在生物制藥行業，連續制造通常被認為是提高生物生產效率的方法。與批處理相比，它可以在更小的設備內生產更多的產品，同時提高產品質量，尤其是對敏感和不穩定的分子。對上游和下游操作進行連續方法的相關調查表明：為將連續培養的優勢充分實現，即細胞培養、收獲和產品純化必須有效地集成。這是行業內的趨勢：將包括生物生產和生物過程的平臺包括種子生物反應器等過程視為一個整體，統籌處理。

細胞培養操作在確定整個生產過程中起著至關重要的作用。在過去幾十年中，該行業在從補料分批培養中獲得更高的產品效價方面取得了很大的進展。其中一個結果是向更小的生物反應器邁進，用一次性技術取代舊的不銹鋼設備。一些公司選擇發展灌注過程。他們是尤其是在生產不穩定，半衰期短的治療產品過程中，優勢明顯。

在灌注控制下，蛋白質可以不斷地從培養容器中提取并在降解前純化。營養物質的不斷增加和有毒代謝物的去除，使灌注培養能夠在數周內達到，并維持高的細胞密度。這不僅是一個高生產率的條件，而且還允許細胞保持在一個穩定的狀態，并表達一致性的產品。細胞培養基質量的發展以及細胞過濾器強度的增加都為細胞連續培養起到了推動作用。

然而，該技術仍然存在一些缺點，包括長時間操作細胞培養的挑戰：例如，防止污染和在收獲和純化多批次過程中一致性的驗證。這些問題在新藥研發過程中尤為重要。因此，一些公司決定在采用灌注模式，通過保留新的培養基和通過超濾裝置去除被耗盡的培養基，從而收集產物（有時稱為濃縮進料批處理模式）。可以達到和維持非常高的細胞密度，在短時間內提供很高的生產率，而不需要額外地對多個“子批次”進行收集和純化。

然而，連續上游操作的全部潛力尚未全部挖掘。新技術的運用，將臨床前，臨床，商業化規模生產的效率得到很大提高。由于可以達到如此高的滴度，一些熱銷的藥物也會采用2000L一次性生物反應器進行生產。這樣操作的優點就是省略了一個額外的放大步驟，并以此消除與時間和進一步調節過程中所產生的風險。此外，藥物制造商可以利用灌注操作中，可以充分利用一次性反應器的所有優點。

 

生物反應器接種和初始批處理階段后，使用細胞截留裝置，以恒定的收獲流速去除無細胞上清液。同時，等量補充新鮮培養基繼續培養。通過稱重傳感器接收信號的飼料泵或一個平臺平衡來實現培養基添加的控制，這樣操作員就可以保持一個確定的生物反應器重量。多種方法可以使用，包括基于營養水平來調整日常培養基添加量。

隨著細胞密度的增加，營養消耗和代謝物的積累，需要提高新鮮培養基的交換率，或者，也就是每天遵循一個預設定程序進行培養基交換。在線生物量測量，提供了一種基于細胞密度信號，從而控制灌注或細胞濾出率的自動選擇方法。使用在線葡萄糖和乳酸測量的生物反應器中，操作員通過添加濃縮飼料可以控制葡萄糖濃度。圖1中的示意圖顯示了一個典型的集中灌注或分批設置。

典型的灌注率下降到每天一至兩反應器體積的范圍。采用較低的細胞濾出速度可以建立恒定的細胞生長速率，并且可以維持高的存活率，進而最大限度避免細胞截留裝置的堵塞。根據細胞截留膜的孔徑大小或截留率，蛋白質產物將存在于在無細胞上清液（微濾灌注）中或保留在生物反應器中（超濾灌注）。由于大多數抗體是相對穩定的，所以在生物反應器中直接灌注的策略，為這種產物的積累提供了一種簡單而直接的方法，增加給定抗體制造設施的空間/時間產量。對于易降解的重組蛋白，微濾灌注是一種較好的選擇。那些可能表現出反饋抑制作用的產物，應盡可能快地從細胞培養中分離出來，然后在隨后的純化過程中轉移到冷卻的收獲罐中。使用賽多利斯一次性攪拌槽生物反應器（聯合多種尺寸的細胞截留裝置），可以在2L體積水平進行灌注。例如，一個公司可以使用德國貝朗或b-dcu控制器，隨后規模擴大過程至500L，1000L水平時，BIOSTAT STR系統。在1000升和2000-L水平，細胞截留裝置（例如，Repligen的ATF系統過濾模塊）通過一個使用生物反應器包有二合一側端口。通過生物反應器的外部環無菌連接器進行操作。

另外，Spectrum Labs和其他公司建議一次性反應器使用中空纖維模塊，在切向流模式下保持細胞截留。也可以使用連續離心的方式對細胞進行截留。連續離心的優點是，它避免了過濾器堵塞，并允許死細胞選擇性地分離和去除。

對于所有這些選擇，至關重要的是，保證外部循環盡可能短，以避免細胞培養物暴露于不受控制的環境條件，最關鍵的是那些與溫度和溶解氧有關的（DO）因素。

 

灌注成功的關鍵是高效的鼓風系統，這樣可以為細胞培養提供充足的氧氣。在增強的培養過程中，會形成大量的二氧化碳，必須去除，以防止抑制產物形成的或對產品質量產生的潛在的負面影響。在BIOSTAT STR一次性生物反應器中，許多微型噴頭構成一個大型噴霧器，通過150微米孔，壓縮空氣并對其進行凈化。這種一次性噴射器的模塊已在傳統的不銹鋼反應器應用多年。

一個不可忽視的問題是，由于高速氣體流量和濃縮細胞培養液中的蛋白質含量，會導致廢氣排放過程中形成過多的氣溶膠。一個專門開發的基于板式換熱器原理設計的一次性排氣冷凝器，可以減少堵塞過濾器的風險，并大大提高可靠性。賽多利斯生物反應器額外的安全聯鎖控制軟件會防止因堵塞的細胞截留裝置而導致細胞溢出。此外，所有進料泵和氣流如果超過其最大工作壓力，則將會中斷進料。

接下來，我們將討論兩種不同的一次性2000L單抗生產生物反應器。

 

美國一家大型生物技術公司評估了新系統在現有的一次性和不銹鋼生物反應器在兩個灌注過程中的性能。這兩個過程都使用了一個普通的細胞截留裝置和中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系產生兩種不同的單克隆抗體。2000L是最大的反應器。三葉片段葉輪低剪切力攪拌用于均勻混合。150um孔徑噴頭保證氧氣交換率在<40h-1。經典的攪拌槽的設計保證了其使用符合單位體積內功率輸入和葉尖速度等標準。幾何設計的相似性，保證了賽多利斯反應器能從250ml無縫放大到2000L。

BIOSTAT STR生物反應器的袋子是用新S80多層聚乙烯薄膜。生物合成也可以用該種薄膜，其將來也可用于儲存，凍融等方面。這將為公司減少開支，無需購買其他材料。在細胞培養中，S80薄膜提供可再生的細胞生長可以媲美的硼硅酸鹽玻璃。這種生物反應器（包括耗材）已在1000升的規模使用CHO分批單克隆抗體的生產過程得到證實。

為了對該系統進行基準測試，并證明其與現有的一次性使用生物反應器功能的等價性，該公司使用連續細胞培養法生產單克隆抗體A。這是一個比生產單克隆抗體A更苛刻的過程，因為它產生更高的細胞密度，需要更多的氧氣。這種情況對一次性生物反應器來說是很有挑戰性的，因為這些生物反應器通常不能用來處理如劇烈的排氣過程。 

 

單克隆抗體-生物反應器的功能等價性的標桿：圖2顯示的是可行Biostat STR 2000 system的細胞密度（VCD）和細胞存活率（%）與現有的一次性生物反應器的歷史數據比較。前者的平均數據屬于這些歷史數據產生的平均值正負一個標準差范圍內。

圖3（top）比較來自兩個生物反應器的填充細胞體積數據（%）。結果表明，這兩個系統具有高度的相似性。圖3（bottom）packed-cell adjusted product titers顯示兩個系統也有很高相似性。從這些結果，我們可以得出結論，新系統在功能上等同于現有的2000-L一次性使用生物反應器。與歷史數據相比，維持新系統培養點所需的氧氣較少，這表明氧傳遞能力更好。

單抗B生產：對BIOSTAT STR進行一個更具挑戰性檢測： 兩種單抗B生產均在過BIOSTAT STR 2000系統中完成。其中一個過程比另外一個的運行時長多25%。對于較短的過程，VCD和百分之活率與現有的一次性使用生物反應器的歷史數據相比較（圖4）。

Packed-cell adjusted product titer數據顯示兩者也有著很高的相似度。但是在該過程中，兩種生物反應器存在一個明顯的差異：在新系統中總的氣體流量和氣裹壓力壓力通常比其他一次性使用的生物反應器低。顯然，前者的氧傳遞效率更高。其較低的氣體流量可減少氣泡破裂引起的剪切損傷，降低因泡沫堵塞排氣過濾器的風險。這種新的生物反應器大的頂部空間可以進一步減輕這種風險。圖5說明了兩種單用生物反應器在通氣性能上的差異。上述結果表明： MAb B可以用BIOSTAT STR 2000系統進行一個較長時間的生產。

整體上來看，因為一次性生物反應器的氧傳遞受到限制，只有在不銹鋼生物反應器中才有可能。

第二組培養過程在BIOSTAT STR 2000系統（具有較長的不銹鋼反應器）中進行。圖6和圖7顯示了兩者的一致性。一次性生物反應器提供的較低的總氣體流量足以支持細胞生長和產物形成，顯示了系統的優越氧傳遞。圖6還顯示了一次性系統在兩種不同攪拌速率下的性能。顯然，氧傳遞速率不一致性是該生物反應器的限制參數，如果能解決這個問題，則打開了更長的過程、更高的細胞密度和更高的生產率的大門。

我們已經證明，BIOSTAT STR 2000系統在連續生產單克隆抗體方面，能夠提供，現有的一次性生物反應器相當的性能。由于其優越的氧轉移率，所以發酵過程中只需要更少的氣體。這樣就降低了生物反應器中過多的泡沫和壓力積聚造成排氣過濾器堵塞的風險。生產第二種抗的過程中其要求更高，憑借其優越的氧轉移效率，使培養物比其他一次性生物反應器運行更長的時間。新系統的工藝性能與不銹鋼系統相媲美。所以BIOSTAT STR2000系統，生產單個單抗時，可以以更高的細胞密度，生產更多的單抗產品，可以的連續運行的同時保留了一次性處理所有的優點。

新興技術應用于細胞培養過程的開發、規模化和過程控制。一旦這些應用與高性能、單用途的生物反應器相結合，那么極高的細胞密度培養就成為了現實。關鍵工藝參數的控制需要先進的過程控制軟件和適當的過程分析程序。氧和二氧化碳傳感器可安裝與生物反應器排氣線路，以監測和提供額外的觀察細胞培養代謝。在連續細胞培養過程中，可以使用營養物質和代謝物如葡萄糖和乳酸的測量值來提供營養供應和培養的一般代謝狀態的信息。這些信息可以幫助公司使用全自動控制回路確定最合適的營養供給率。

自動化可行的生物測量完全可以集成到一次性生物反應器中，以提供獨立的生物觀測信息。線測量減少了手工取樣的必要。通過將這種傳感器安裝在生物反應器控制系統中，使在連續培養過程中自動監測和控制成為可能。

生物反應器和細胞培養技術不斷發展，使細胞密度得到提高和保持。生物制藥公司是否選擇分批補料工藝或開發連續細胞培養方法將取決于它們各自的情況。技術創新將使他們能夠加快臨床試驗的速度，并在預定的設計空間內開發出高滴度的抗體。

 

 

參考來源：

Continuous Cell Culture Operation at 2,000-L Scale by Christel Fenge, Nick Hutchinson, Michael Sherman, Vincent Lam and Melissa Carpio

 

賽多利斯斯泰帝(Sartorius Stedim Biotech)是國際領先的生物制藥行業設備和服務的供應商，為全球生物制藥的開發與生產提供安全、及時、經濟的一體化解決方案。作為完整解決方案的供應商，賽多利斯斯泰帝提供幾乎涵蓋生物制藥工藝所有步驟的產品組合。公司致力于推廣一次性使用技術和增值服務，滿足生物制藥行業快速發展的技術需求。公司總部位于法國歐巴涅，在巴黎的歐洲交易所上市；因其位于歐洲、北美和亞洲的生產與研發中心以及遍布全球的銷售網絡而享譽世界。

 

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