【貨號和規(guī)格】T115-01，20 rxn
【產(chǎn)品概述】
    隨機(jī)突變是闡述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系、改進(jìn)蛋白質(zhì)性能的重要工具。StarMut隨機(jī)突變試劑盒基于易錯PCR (error-prone PCR) 技術(shù)，利用Taq DNA polymerase不具有3′→5′校對功能的特性，在特定的反應(yīng)緩沖體系中，向擴(kuò)增的目的基因中引入隨機(jī)突變密碼子。帶有隨機(jī)突變的擴(kuò)增產(chǎn)物通過雙酶切，連接到表達(dá)載體中構(gòu)建文庫，然后轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主中，進(jìn)行蛋白活性篩選。如果經(jīng)一次突變反應(yīng)不能獲得滿意的結(jié)果，可采用連續(xù)易錯PCR (sequential error-prone PCR)策略，即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變，使每一次獲得的突變累積而產(chǎn)生更有意義的突變。
    本試劑盒包含有優(yōu)化的2 x StarMut Random System、StarMut Enhancer和ddH2O三種組分，使用時只需加入適量的DNA模板和合成的兩條擴(kuò)增引物，并用水補(bǔ)足體積，即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，操作簡便快速，大大減少了多次加樣可能造成的出錯和污染機(jī)會。2 x StarMut Random System含有優(yōu)化濃度的Taq DNA polymerase、dNTPs、反應(yīng)緩沖液和穩(wěn)定劑，可最大限度地克服常規(guī)易錯PCR 技術(shù)中，由于Taq DNA polymerase本身的偏愛性造成的以GC突變?yōu)橹鞯娜秉c(diǎn)，獲得相對均衡的突變譜。堿基突變率可通過適量添加StarMut Enhancer、調(diào)整模板DNA量和改變PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行控制。
    下表列出以10 ng質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增一條1 kb DNA片段(20個循環(huán))后測序檢測得到的突變率結(jié)果。需要注意的是，由于不同DNA模板的堿基組成不同、長度不一，以及不同引物的擴(kuò)增效率存在差異，所以即使在相同的PCR反應(yīng)條件下，兩組PCR產(chǎn)物所得到的突變率也可能不同。因此我們建議根據(jù)實(shí)驗的具體要求，首先進(jìn)行多個小體系(20 μl)擴(kuò)增預(yù)實(shí)驗，分別加入不同體積的StarMut Enhancer(如0 μl、1μl、5 μl、10 μl等)，摸索出符合目標(biāo)突變率的反應(yīng)條件后，再放大擴(kuò)增體系。其他影響突變率的因素見【注意事項】。

【產(chǎn)品組分】
2 x StarMut Random System
0.5 ml
StarMut Enhancer
0.1 ml
ddH2O
1 ml
 
 
【保存條件】
−20℃保存，有效期一年；經(jīng)常使用，可于4℃保存，有效期三個月。
【使用方法】
1．引物設(shè)計原則：
(1)   正、反向擴(kuò)增引物各一條，長度約20~45個堿基，3’端分別與目標(biāo)突變DNA片段的上下游結(jié)合；
(2)   盡量將引物的GC含量控制在40~60%；
(3)   引物如帶有克隆酶切位點(diǎn)，必須添加足夠的保護(hù)堿基以確保酶切效率；實(shí)驗證明，引物結(jié)合在目標(biāo)DNA片段的酶切位點(diǎn)外側(cè)可提高酶切效率，增加轉(zhuǎn)化的克隆數(shù)量。
2．隨機(jī)突變反應(yīng)：

(1)   PCR反應(yīng)體系：
向PCR薄壁管中依次加入下列試劑
質(zhì)粒DNA模板(1~10 ng/μl) *        1 μl
2 x StarMut Random System       25 μl
正向擴(kuò)增引物 (10 μM)                   1 μl
反向擴(kuò)增引物 (10 μM)                   1 μl
StarMut Enhancer                          0~20 μl
ddH2O 補(bǔ)足體積至                50 μl
(2)   混勻后短暫離心，放入PCR儀。
(3)   PCR循環(huán)參數(shù)的設(shè)置：
95℃       2 min
94℃       30 sec
50~65℃      1 min              x 16~25 cycles*
72℃       1 min/1 kb
72℃       7 min

*突變率可通過改變起始模板濃度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行控制。起始模板濃度越高，突變率越低；擴(kuò)增循環(huán)數(shù)越高，突變率越高。
 
 
3．取1~5 μl PCR產(chǎn)物電泳檢測條帶濃度和特異性。
4．剩余的PCR產(chǎn)物電泳，切膠回收目標(biāo)DNA片段。
5．酶切、連接、轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌株中進(jìn)行篩選。
【注意事項】
1．                 由于不同DNA模板的堿基組成不同、長度不一，以及不同引物的擴(kuò)增效率存在差異，所以即使在相同的PCR反應(yīng)條件下，兩組PCR產(chǎn)物所得到的突變率也可能不同。因此我們建議根據(jù)具體實(shí)驗要求，首先進(jìn)行多個小體系（20 μl）擴(kuò)增預(yù)實(shí)驗，分別加入不同體積的StarMut Enhancer（如0 μl、1 μl、5 μl、10 μl等），通過測序或活性檢測等方法，摸索出符合目標(biāo)突變率的反應(yīng)條件后，再放大擴(kuò)增體系。
2．                 起始DNA模板的濃度對突變率有很大影響，通常可通過提高或降低DNA模板的濃度來調(diào)整突變率。鑒于不同型號的分光光度計檢測的DNA濃度存在偏差，DNA模板最好在酶切線性化后，采用凝膠電泳方法，與已知濃度的線性化雙鏈DNA或商品化的DNA marker進(jìn)行對比，確定其濃度。
3．                 突變反應(yīng)產(chǎn)物必須進(jìn)行切膠回收處理，去除DNA模板、PCR產(chǎn)物上結(jié)合的Taq酶以及其他雜質(zhì)。常規(guī)的乙醇沉淀、硅膠膜（珠）或玻璃奶吸附等方法，均無法去除結(jié)合的Taq酶，后者可能遮蔽酶切位點(diǎn)，影響克隆效率。
4．                 建立隨機(jī)突變文庫通常需要10~200 ng/μl （相當(dāng)于500 ng ~10 μg/50 μl體系）的PCR產(chǎn)物。如遇產(chǎn)量不足，可通過下列方法提高產(chǎn)量：
(1) 突變率符合需求時，可放大PCR體系，或切膠回收PCR產(chǎn)物后，采用常規(guī)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增；
(2) 突變率低于需求時，提高PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，或切膠回收PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行第二輪隨機(jī)突變反應(yīng)；
(3) 重新設(shè)計擴(kuò)增引物;
(4) 降低退火溫度；
(5) 確保模板質(zhì)量，采用凝膠電泳方法精確定量。
5．                 對于帶有克隆酶切位點(diǎn)的DNA模板，必須在PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用DpnI完全消化清除甲基化的模板，再切膠回收目標(biāo)DNA片段。對于非甲基化的質(zhì)粒（例如從大腸桿菌JM110或SCS110菌株中提取的質(zhì)粒），可通過轉(zhuǎn)化dam＋的大腸桿菌菌株（如DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue等），再抽提獲得甲基化的質(zhì)粒作為PCR反應(yīng)模板。
6．                 經(jīng)過雙酶切的克隆載體在插入突變DNA片段前，應(yīng)首先通過自身連接檢測，確保極低的自連背景。必要時可采用去磷酸化、切膠回收等方法把自連率降至最低，以免影響后續(xù)連接反應(yīng)。
【備注】
本產(chǎn)品僅供科研使用。在確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)問題時，本公司承諾為客戶免費(fèi)更換等量的質(zhì)量合格產(chǎn)品。在所有情況下，本公司對此產(chǎn)品所承擔(dān)的責(zé)任僅限于此產(chǎn)品的價值本身。