超濾技術在制藥工業中除熱原的應用

《膜科學與技術》1999年第19卷第3期8～12頁

樓福樂  毛偉鋼  陸曉峰  梁國明

（中國科學院上海原子核研究所，上海  201800）

陸文達  黃梅菊

（上海福達藥業有限公司，上海  201400）

 

摘  要    介紹了熱原的本質，它的定量表示及測定方法。隨著膜分離技術的快速發展，采用超濾法去除注射液中的熱原已在醫藥行業實際應用。列舉了國外多項應用實例，并介紹了中國科學院上海原子核研究所生產的卷式超濾裝置在藥液除熱原工藝中的使用情況。

關鍵詞    熱原  超濾  卷式超濾裝置

分類號    TQ028.8

 

隨著膜分離技術的迅速發展，在制藥工業中應用超濾膜分離工藝除去（或降低）注射用藥物（藥液）中熱原含量，使之符合藥典規定，正在日益廣泛的應用。例如日本、美國藥典允許大輸液除熱原采用反滲透和超濾單元。而國內也正在探索和尋求用國產超濾設備去除熱原的方法和工藝。中國科學院上海原子核研究所研制、生產出多種材質和規格的超濾膜以及板框式和卷式超濾系列設備，已在許多領域應用，為了在制藥工業除熱原項目的推廣使用，筆者在有關文獻的調研基礎上進行了應用試驗工作，并取得成功，從而促進超濾法除藥液中熱原這一工藝得到應用開發。

1    熱原

1．1熱原的本質

M.Thmas等[1]指出，熱原（Pyrogen）又稱內毒素（Endotoxin）,產生于革藍氏陰性（Gram-nagative）細菌的細胞外璧，亦即細菌尸體的碎片。它是一種脂多糖物質（Lipopoly-saccharide），簡稱LPS，其相對分子質量從幾千到幾十萬不等，根據產生它的細菌種類而定。在水溶液中，其相對分子質量可為幾十萬到幾百萬不等。最近已揭示了類脂A（Lipid）也是熱原物質，構成為危害人體的內毒素，相對分子質量大約為2000。

永田彥等指出[2]，發熱性物質即熱原有兩類：一類是低相對分子質量發熱物質.

收稿日期：1998-10-12；修改稿收到日期：1998-11-23

第一作者：男，56歲，高級工程師.

（Pyretice），另一類是高相對分子質量發熱物質（Pyrogen），它們統稱為內毒素。一般認為熱原是指細菌發熱物質，它由革藍氏陰性細菌的細胞壁的外膜構成。更進一步分析其主要成份是脂多糖（LPS）及類脂A，是熱原的活性部分。它們的相對分子質量一般為1萬～2.5萬，在水溶液中形成締合體，相對分子質量可達50萬～100萬。這類物質具有耐熱性和化學穩定性，不易被除滅。

表1  LPS加熱失活時間

加熱溫度℃	LPS失活時間/min
250	30以上
200	60以上
180	120以上

1．2熱原的定量表示

熱原可以用濃度來定量標度。文獻大都以每毫升克數為濃度單位，一般單位為ng/ml，即10-9g/ml，或pg/ml，即10-12g/ml。也有采用EU/ml為熱原單位。我國1998年藥典確定用EU/ml為熱原單位。兩個單位之間的換算關系比較復雜，因為來自不同種類細菌的熱原毒性表現不盡一致。美國有關部門對大量試樣數據采用概率統計方法提出如下結果：對EC2類細菌1ng/ml＝5EU/ml；類細菌1ng/ml＝10EU/ml。日本藥檢部門報告對EKT類細菌1ng/ml＝8EU/ml。

1．3熱原的測定方法

熱原的分析、測定方法主要有鱟試劑法和家兔法。

1．3．1鱟試劑凝膠法

該法是利用鱟試劑檢測供試品中或其表面可能存在的細菌內毒素濃度的一種方法[3]。目前，各國藥典收載的細菌內毒素試驗法均包含凝膠法。藥品細菌內毒素檢查是以凝膠法為基礎，通過試驗證明供試品某一濃度對凝膠法不存在干擾作用后，在供試品的有效濃度范圍內，根據供試品的內毒素限值進行檢測的一種方法[4]。

1．3．2家兔法

該法則為各國藥典中規定的標準檢測方法，可簡述為取3只健康家兔各注入規定量的試樣，在一天內單兔體溫上升不超過0.6℃，3兔總升溫不超過1.4℃，即被認為試驗中熱原含量合格。

1．4熱原對人體的危害

據文獻[2]報道，將熱原濃度為5ng/ml的試樣注入家兔體內，總量達到50ng/kg（體重）時，家兔體溫上升值達0.6℃。人體感染發熱的靈敏度是家兔的3倍。如有微量熱原混入藥劑中注入人體血液系統，會導致嚴重發熱，甚至引起死亡。因此，盡可能降低藥液中熱原的含量是十分必要的，特別當注射液（如大輸液）用量較大時，對熱原的濃度要求應更為嚴格。例如上海長征制藥廠對大輸液的熱原合格指標控制值為0.25EU/ml。

2    超濾膜分離法去除藥液中熱原

注射用藥液（或注射用水）除熱原，使之符合藥典的檢測規定，是醫藥工業中的基本生產環節。目前，一般介紹除熱原的方法有以下3類：

⑴蒸餾法生產去熱原水，作注射用水、洗滌水等，但其成本較高。

⑵吸附法除熱原。其中方式一是表面吸附劑吸附致熱性物質，而讓產品物質通過。方式二是吸附劑吸附產品物質，讓熱原流出，再把產品物質從吸附劑表面解析回收。用作吸附的物質可以是硅泥、活性炭和離子交換樹脂等。禁止使用石棉作為吸附劑。

⑶膜分離法除熱原作為一種新工藝、新技術，正在制藥行業推廣應用。

2．1超濾法除熱原

超濾法除熱原是一種物理分離方法，選用何種規格的超濾膜為宜，首先須了解藥液中e熱原的相對分子質量大小、性質以及濃度。

文獻[1]提出，由于脂多糖的終端結構類脂A具有較小的相對分子質量，因此需選用切割相對分子質量小于5000相對分子質量的超濾膜。如果選用截留相對分子質量為1萬至20萬的超濾膜，除去相對分子質量為幾萬到幾百萬的熱原，則應再使用熱原吸附劑除去小相對分子質量的熱原，包括相對分子質量約為2000的類脂A。這些不同規格濾膜的平均孔徑為2nm到0.1μm

稻見良秋等報道[5]，用超濾法除熱原，必須采用孔徑為1nm的超濾膜，截留相對分子質量6000左右。但產量低，處理量大時，設備大型，壓力要求也較高。其次，采用截留相對分子質量規格為5000或10000的超濾膜除熱原，對部分含有較大相對分子質量成份的藥液是不合適的。因為，在除去熱原的同時會把藥液中的有效成分阻留與吸附，使產品得率大受影響。因此，也有選用10萬至30萬截留相對分子質量的濾膜除去大部分發熱性物質后（產品物質基本上通過濾膜），再采用熱原吸附劑除去余下部分熱原，使得產品收得率既高，去除熱原效果又好。為了提高產量，采用聚酰胺（尼龍）為原料制成的微孔濾膜，過濾熱原濃度為20ng/ml的自來水，由于材質具有特異的吸附熱原的特性，過濾后的水質符合藥典規定，其產量高達2000L/（m2·h）。

K.Mueeller報道[6]，除熱原用超濾膜的截留相對分子質量規格是6000。

永田彥在其專利[2]中稱，一般的注射液，為除去低相對分子質量發熱物質，采用截留相對分子質量1萬的超濾膜。

田原修等[7]采用截留相對分子質量為1萬的超濾膜，平板式裝置，除去乳酸鈉中的熱原。

橋本雅文[8]指出，一般從低相對分子質量藥液中去除熱原采用截留相對分子質量為1萬的濾膜，包括靜脈注射液除熱源。

M．M．Solin報道[9]，用尼龍66制成的帶電荷微孔濾膜，孔徑大小為0.1、0.2μm和0.45μm，也可用于對相對分子質量為4萬的葡聚糖溶液除熱原。其中0.45μm的微孔膜作預處理，0.1μm和0.2μm的微孔膜進一步作除熱原處理。

綜上所述，超濾膜孔徑及材質的選擇，需視被處理藥物的相對分子質量、特性，及藥品中熱原的含量而定，通過工藝試驗選擇最為合適的超濾膜規格及處理工藝。

2．2超濾法除熱原的效率

由于超濾膜的活性層很薄，用久了可能會出現針孔，降低截留率造成熱原和細菌的泄漏，另外設備結構上的不合理也可能存在衛生死角而影響濾清液的質量，若再加上存在類脂A的致熱物質，因此超濾除熱原的效果往往達不到百分之百的清除，表2就文獻報道中的有關數據予以歸納。

表2  超濾除熱原效率

項目	熱原濃度/（ng·ml-1） 原液       濾清液		去除率 /%	濾膜規格 膜孔徑/μm	截留相對分子質量/萬
SOD藥液除熱原	約1萬	1～10	99.9～99.99	—	10
HAS的精制	1300	3	99.8	—	8
乳酸鈉除熱原	__	__	＞97	—	1
制備超純水	7.1	＜0.1	＞98.6	0.01	—
自來水除熱原	20	合格	～90	0.2	—
藥液	500	—	＞97	0.1	—

由表2可見，超濾膜對熱原的去除率較高，變化范圍較寬，高達99.99%，低為90%以上。究其原因可知，熱原是一類形態和相對分子質量均不確定的物質，熱原的種類、濃度隨藥液而異，因此熱原去除率也是個多因素決定的量。

3    超濾除熱原國內外應用實例[10～13]

3．1 SOD藥液除熱原[2]

用二級處理工藝，超濾 + 吸附法，使SOD藥液的回收率、產量、重復性、可靠性和經濟性方面都十分優異。

濾膜截留相對分子質量為10萬，對牛血清蛋白（相對分子質量6.7萬）的截留率為60～80%，二級脫熱原吸附劑經篩選后確定，對藥液的化學組分適當調整，有利于提高收率。超濾膜的再生采用通常的1mol/L的NaOH浸泡處理，吸附劑的再生經三步處理。SOD藥液經家兔法檢測，呈陰性。處理結果列于表3。

表3  超濾、吸附法除SOD藥液中熱原

 

發熱性物質去除方法	熱原濃度/（ng·ml）-1 處理前       處理后		SOD回收率/%
膜過濾+去熱原吸附劑處理	約1萬	0.01以下	96
膜過濾	約1萬	1～10	98
吸附法（比較例）	約1萬	10～100	—

3．2治療腦血栓新藥（Prourikinase）除熱原[7]

本藥品為治療腦血栓的特效藥，注射治療，藥品中的蛋白質相對分子質量約5萬。為此而研制了截留相對分子質量規格為30萬的超濾膜，用作一級超濾處理。二級處理亦用脫除熱原吸附劑。處理后的主要結果見表4。

表4  超濾、吸附法除Prourikinase藥液中熱原

發熱性物質去除方法	內毒素濃度/（ng·ml）-1 處理前        處理后		藥液成分收得率 /%
膜過濾+去熱原吸附劑處理	0.1～１萬	0.01	＞90
膜過濾	0.1～１萬	1～10	98
脫熱原吸附柱（比較例）	0.1～１萬	10～100	—

3．3乳酸鈉除熱原[6]

由于質量分數為70%的乳酸鈉粘度高，采用截留相對分子質量1萬的濾膜過濾時通量較低。為了提高產量，采取對設備、管路夾套加熱的方法，使料液升溫至50～60℃，這個措施明顯地提高了處理產率，如圖1可見，58℃時的過濾速度為40℃時的2.5倍，而熱原去除率保持在97%以上。溫度超過60℃后，由于膜孔徑放大，膜的截留率下降，致使除熱原效果明顯下降。所以說，超濾法除熱臺對不同的藥液均有一個確定工藝條件的試驗過程.

                  

       圖1  超濾產量與料液溫度關系

3．4制備超純水[14]

采用超濾組件 + 離子交換 + 離子交換纖維三級處理流程，構成小型化超純水制備裝置，滿足電子、醫藥、精密化學分析等部門的使用要求。其中離子交換纖維是專利成果。超濾膜的分離孔徑為10nm，內徑250μm，膜厚30μm，過濾面積1.6m2，裝填混合樹脂MB-2型1.8L，纖維混合體0.2L，流速50L/h，裝置體積45cm×45cm×25cm，質量20kg，一次可制純水600L，水質指標詳見表5.

表5  超純水制備水質一覽表

項目	比電阻 /(MΩ·cm)	鈉 /(ng·g-1)	二氧化硅/(ng·g-1)	細菌/(個·ml-1)	熱原/(ng·ml-1)	＞0.2μm微粒/(個·ml-1)	有機物/(ng·g-1)
原水	0.01	＞600	980	0.6	7.1	1×105	900
超純水	18	1	＜5	0.1	＜0.1	15	70

3.5“超濾＋吸附法”工藝

M．Thomas[1]經過大量試驗，建立了“超濾＋吸附法”除熱原新工藝。該工藝中使用的超濾膜的截留相對分子質量為1萬～20萬，膜的平均孔徑為0.002～0.1μm，通常為3～20nm，這種膜具有較大的空隙和較高的通量，可去除相對分子質量數萬至幾百萬的熱原，然后用除熱原吸附劑除去相對分子質量幾萬以下的熱原以及相對分子質量大約為2000的類脂A物質。該工藝在超濾膜使用較長時間截留率降低后，熱原也可以被吸附劑除去，并且相對分子質量為2000的類脂A也能有效去除。該工藝可以使醫藥的有效成分很容易地透過膜，從而提高藥品的收得率。

該工藝使用的超濾膜材質有聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺等，設備形式可以為中空纖維、卷式、折疊式或板框式等。這些不同形式的設備各具有特點，其中由卷式超濾組件構成的設備膜面積大，濾膜更換方便，但對原液的預處理要求較高。中空纖維超濾組件的濾膜裝填密度高，泵容量小，但不能單獨換膜，對原液預處理要求高。板框式超濾設備原液預處理容易，濾膜可單張更換，單設備體積較大，預清洗有一定難度。

該工藝采用多種材質與型號的吸附劑。對原液中的熱原濃度要求低于104ng/ml為宜。

該工藝的應用實例包括制備酶制劑，合成蛋白質、肽、荷爾蒙和多糖物質的藥類，大輸液如葡聚糖輸液、果糖輸液、葡萄糖輸液等。檸檬酸鈉注射液的生產也可采用本項工藝。

應用實例，人體血清蛋白（HSA）的精制，先用截留相對分子質量為10萬的中空纖維超濾膜組件過濾，再流經裝有吸附劑的吸附柱。HAS的質量分數從5%降至3.2%或3%，熱原則從1300ng/ml分別降至3ng/ml和0.016ng/ml。產品的回收率為60%，超濾熱原的去除率為99.8%，全工藝為99.998%。