‍蛋白質組學介紹

        蛋白質組（Proteome）是指基因組表達的所有相應蛋白質的集合，即細胞、組織或機體全部蛋白質的存在及其活動方式。蛋白質組學（Proteomics）是指利用高分辨的蛋白質分離技術和高效的蛋白質鑒定技術在蛋白質水平上整體性、動態和定量地研究生命現象及規律的科學，是系統生物學的有機組成部分。

   
        蛋白質組是空間和時間上動態變化著的整體，一個基因組對應多個蛋白質組。相比穩定的基因組，蛋白質組是遺傳信息、環境因素、生活習慣等多因素的綜合體現。同一細胞/組織，在不同時間/不同環境條件下蛋白譜的表達也存在不同。如上圖所示：線粒體呼吸鏈酶家族的蛋白表達水平不僅在不同成人器官中存在顯著差異，同樣在心臟中，胎兒與成人蛋白表達量也差異巨大。因此，蛋白質組能實時反映細胞/組織功能和疾病發生狀態的一類分子，也是疾病發生較為相關的分子類型，具有廣闊研究前景。

 

蛋白質組學定性原理

  
        隨著高效液相分離技術（HPLC）和靜電場軌道阱（Orbitrap）質譜技術的發展，液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）成為目前蛋白質組學分析的主要技術。其鑒定蛋白質的基本步驟（bottom-up）一般如右圖所示：收集樣本后進行總蛋白質提取→消化切割蛋白為多肽片段→HPLC分離→分級進入MS電場進一步離子化→MS獲得各離子質荷比和峰型信息→軟件計算氨基酸組成→數據庫檢索比對獲得蛋白質的定性和序列信息。

 

蛋白質組學定量原理

        基于LC-MS/MS技術的蛋白質組定量技術一般分為標記法和非標記法兩種類型。目前常用的標記法有：iTRAQ（體外）、TMT（體外）、SILAC（體內）三種基于同位素標簽進行半定量的方法。以常用的iTRAQ蛋白質組學定量為例（如下圖）：iTRAQ是由8種（113/114/115/116/117/118/119/121）同位素標簽組成，在實驗過程中將8例不同樣品分別酶解成多肽片段→分別標記8種同位素標簽→將8例標記好的多肽樣品混合成1例總樣品→進入LC-MS/MS分析系統→二級MS階段iTRAQ平衡基團發生中性丟失，在低質量區產生多個報告離子→計算各報告離子峰面積，獲得同一肽段不同樣品間的相對豐度差異比值→加權計算肽段豐度獲得總蛋白質相對定量值。

‍

 
        以iTRAQ技術為代表的體外標記技術是目前應用廣泛的蛋白質組學半定量檢測技術，其操作簡單，數據穩定性高。然而，受到同位素標簽數量的限制，在進行大批樣品實驗時，以Label Free和DIA為代表的非標記定量蛋白質組學技術則具有更多優勢，詳細信息見子網頁。

 

華盈生物蛋白質組學服務

蛋白質組學數據分析平臺

經典文獻賞析‍

‍如何利用TMT技術實現多樣品蛋白質組學定量分析

        2017年5月美國學者Pamir N等運用TMT標記技術成功完成了20例小鼠脂肪組織蛋白質組定量比較。相關研究工作發表在蛋白質組學代表性雜志《Molecular & Cellular Proteomics》上（PMID: 28325852）。該研究實驗設計巧妙，突破了iTRAQ和TMT等體外標記蛋白組學技術在同位素標簽數量上的限制。
 

• TMT蛋白質組學定量研究實驗設計

        研究人員將8周齡的20只小鼠處理分成四組（每組5只小鼠）：分別低脂喂養8周和18周，高脂喂養8周和18周。分別取各小鼠附睪脂肪組織進行3組TMT蛋白質組學定量分析，共計20例樣品。將3組質譜數據通過pool樣內標進行校準獲得可比性，而后進行組間蛋白譜比較，獲得衰老（aging）和高脂飲食（HF）調控的脂肪組織特征蛋白譜，重新認識衰老與高脂飲食誘導的代謝紊亂疾病的物質基礎，具體實驗設計，見圖1。
 

                                                    圖1 多樣本TMT蛋白質組學技術路線
 

• ‍高脂飲食易造成代謝紊亂‍

        經過18個月高脂飲食喂養，小鼠出現了代謝狀態系統性紊亂，隨時間增長逐漸加劇。在低脂狀態下，衰老是引起代謝紊亂主要因素，但紊亂程度較高脂環境要輕，見圖2。
 

                                                         圖2 高脂飲食和衰老造成糖脂代謝紊亂
 

• 蛋白質組改變伴隨代謝紊亂發生‍‍

       
        通過對比分析組間定量蛋白質組學數據的差異，研究人員發現衰老是引起蛋白質組變化的重要因素。而在高脂環境下，衰老對于蛋白質組的調變影響將被放大，表現為代謝相關差異蛋白顯著增多。
 

                                                  圖3 高脂飲食和衰老造成蛋白質組顯著調變
 

 
        通過對差異蛋白譜進行蛋白互作網絡分析和GO功能分析，進一步明確了，衰老因素主要通過調控脂代謝、氨基酸代謝相關蛋白群改變引發代謝紊亂。而在高脂環境下，衰老對免疫系統、補體激活、基質重塑等蛋白群又產生了新的影響，造成了更嚴重的代謝紊亂發生，見如圖4。
 

                                                        圖4 差異蛋白譜互作網絡分析
 

 
        小結：通過本文可以看出，蛋白質組學研究具有很大的發展空間，可以填補很多研究知識上的空白。良好的實驗設計可以突破技術限制，并讓實驗數據具有更強的說服力。
 

        華盈生物致力于從實驗設計 → 實驗執行 → 數據分析，提供一系列高標準蛋白質組學技術服務，為行走在科研道路上的科學家增添動力。

 

參考文獻

‍

1. Tan H, et al. Integrative proteomics and phosphoproteomics profiling reveals dynamic signaling networks and bioenergetics pathways underlying T cell activation. Immunity, 2017, 46(3): 488-503.

2. Liao L X, et al. Highly selective inhibition of IMPDH2 provides the basis of antineuroinflammation therapy. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(29): E5986-E5994.

3. Zhang W, et al. LC-MS/MS-based targeted proteomics quantitatively detects the interaction between p53 and MDM2 in breast cancer. J Proteomics, 2017, 152: 172-180.

4. Tsimokha A S, Zaykova J J, Bottrill A, et al. Extracellular proteasomes are deficient in 19s subunits as revealed by itraq quantitative proteomics. J Cell Physiol, 2017, 232(4): 842-851.

5. Guo J, Jing R, Zhong J H, et al. Identification of CD14 as a potential biomarker of hepatocellular carcinoma using iTRAQ quantitative proteomics. Oncotarget, 2017.

6. Plubell D L, et al. Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue. Mol Cell Proteomics, 2017, 16(5): 873-890.

7. Zhang R, et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature, 2016, 535(7610): 164-168.

8. Miller M R, et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science, 2016, 352(6285): 555-559.

9. Miki T, et al. A conditional proteomics approach to identify proteins involved in zinc homeostasis. Nat Methods, 2016, 13(11): 931-937.

10. Baskin J M, et al. The leukodystrophy protein FAM126A/Hyccin regulates PI4P synthesis at the plasma membrane. Nat Cell Biol, 2016, 18(1): 132.

11. Arribas-Layton M, et al. The C-terminal RGG domain of human Lsm4 promotes processing body formation stimulated by arginine dimethylation. Mol Cell Biol, 2016, 36(17): 2226-2235.

12. Ferreira E, Shaw D M, Oddo S. Identification of learning-induced changes in protein networks in the hippocampi of a mouse model of Alzheimer's disease. Transl Psychiatry, 2016, 6(7): e849.

13. Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature, 2014, 509(7502): 582.

14. Poljak, A., et al. Quantitative proteomics of delirium cerebrospinal fluid. Transl Psychiatry, 2014, 4(11): e477.