YIJI 植物磷脂酶D（Phospholipase D）總水解活性酶連續循環比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 植物磷脂酶D（Phospholipase D）總水解活性酶連續循環比色法定量檢測試劑是一種旨在通過磷脂酶D、脂酶、甘油-3-磷酸氧化酶和過氧化酶酶連續反應系統中產生的紅色產物醌亞胺染料，在分光光度儀下峰值的增高， 即采用比色法來測定植物組織裂解樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等裂解萃取樣品中磷脂酶D的總水解活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

磷脂酶（phospholipase），是一種脂質水解酶，催化磷脂的水解，產生脂肪酸和其它親脂產物，參與磷脂代謝。磷脂酶家屬有四種類型亞酶，包括A、B、C和D。磷脂酶A（phospholipase A；PLA）主要水解磷脂sn-1（磷脂酶A1催化）和sn-2（磷脂酶A2催化）位置上的乙酰基；磷脂酶B（phospholipase B；PLB）同時水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙酰基，又稱為溶血磷脂酶（lysophospholipase）；磷脂酶C（phospholipase C；PLC）在磷酸基前水解，釋放二酰基甘油（diacylglycerol；DAG）和第二信使分子三磷酸肌醇（inositol triphosphate）；磷脂酶D（phospholipase D；PLD；EC3.1.4.4）在磷酸基后水解，釋放磷脂酸（phosphatidic acid）。植物磷脂酶D，屬于異源性酶（heterogeneous enzyme）家屬成員，與哺乳動物磷脂酶D不同，有6個異構體：α、β、γ、δ、ε和ζ：PLDα是磷脂酰肌醇4,5二磷酸（phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate；PIP2）-非依賴性的最常見的植物PLD酶，而PLDβ和PLDγ是磷酸磷脂酰肌醇輔因子（polyphosphoinositide cofactor）依賴性；PLDγ在氨基酸序列同源性和生化特性上類似于PLDβ；PLDδ為膜相關性，游離油酸（oleic acid）可以激活。PLD通過催化磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine；PC）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol；PG）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine；PS）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine；PE）上磷酸二酯鍵（phosphodiester）的水解，產生磷脂酸和游離頭端基團（free head group）；磷脂酸作為信號分子，進一步水解為二酰基甘油，與跨膜信號功能、亞細胞結構質膜的降解和重構等有關。同時通過轉移磷脂基團到原生醇類的羥基上的磷脂轉移活性（transphosphatidylation）。PLD及其催化產物參與了植物組織對于環境應急反應，例如創傷、寒冷、干旱缺水、鹽化高滲透壓等。基于底物磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺，在磷脂酰肌醇4,5二磷酸和油酸的輔助下，通過磷脂酶D的作用，水解產生為磷脂酸和各種基團后，通過脂酶（lipase）、甘油-3-磷酸氧化酶（glycerol-3-phosphate oxidase）和過氧化酶（peroxidase）系統，測定紅色產物醌亞胺染料（quinoneimine dye）的峰值變化（500nm 波長），來定量分析磷脂酶D的總水解活性。磷脂酶D連續循環反應系統為：

              

 

產品內容

 

YIJI 清理液（Reagent A）   毫升

YIJI 裂解液（Reagent B） 毫升

YIJI 緩沖液（Reagent C） 毫升

YIJI 反應液（Reagent D） 微升

YIJI 萃取液A（Reagent E） 毫升

YIJI 萃取液B（Reagent F） 毫升

YIJI 萃取液C（Reagent G） 毫升

YIJI 凈化液（Reagent H） 毫升

YIJI 溶解液（Reagent I） 毫升

YIJI 酶促液A（Reagent J） 毫升

YIJI 酶促液B（Reagent K） 毫升

YIJI 底色液（Reagent L）   毫升

產品說明書    1份

 

保存方式

 

保存YIJI 裂解液（Reagent B）、YIJI 反應液（Reagent D）、YIJI 酶促液A（Reagent J）、YIJI 酶促液B（Reagent K）和YIJI 底色液（Reagent L）在-20℃冰箱里，其余的保存4℃冰箱里；YIJI 萃取液A（Reagent E）、YIJI 萃取液C（Reagent G）和YIJI 凈化液（Reagent H）具有揮發性和腐蝕性，注意密閉瓶蓋和操作安全；YIJI 底色液（Reagent L）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品保存和反應操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

恒溫培養箱：用于樣品反應孵育

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

 

 

 

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的xx毫升YIJI 裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI  BCA蛋白質濃度定量試劑盒－yj30031.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

• 測定準備

 

• 開啟并設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為30℃）：波長500nm，并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；YIJI 底色液（Reagent L）避免光照
• YIJI 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 樣品背景對照測定

 

• 移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的15毫升錐形離心管
• 加入50微升待測樣品（100微克蛋白），混勻
• 在30℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx毫升YIJI 萃取液A（Reagent E）
• 加入xx毫升YIJI 萃取液B（Reagent F）
• 加入xx毫升YIJI 萃取液C（Reagent G）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移去上層液相，保留下層液相
• 加入xx毫升YIJI 凈化液（Reagent H）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移去上層液相，保留下層液相
• 重復實驗步驟10至13一次
• 空氣中揮發干化（或使用高速離心揮干）
• 加入xx微升YIJI 溶解液（Reagent I）
• 加入xx微升YIJI 酶促液A（Reagent J），混勻
• 轉移到250微升比色皿或96孔板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 加入xx微升YIJI 酶促液B（Reagent K）
• 加入xx微升YIJI 底色液（Reagent L）
• 上下傾倒數次，混勻 
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為樣品背景空對照

 

• 樣品活性測定

 

• 移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的15毫升錐形離心管
• 加入xx微升YIJI 反應液（Reagent D）
• 加入50微升待測樣品（100微克蛋白）
• 在30℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx毫升YIJI 萃取液A（Reagent E）
• 加入xx毫升YIJI 萃取液B（Reagent F）
• 加入xx毫升YIJI 萃取液C（Reagent G）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移去上層液相，保留下層液相
• 加入xx毫升YIJI 凈化液（Reagent H）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移去上層液相，保留下層液相
• 重復實驗步驟11至14一次
• 空氣中揮發干化（或使用高速離心揮干）
• 加入xx微升YIJI 溶解液（Reagent I）
• 加入xx微升YIJI 酶促液A（Reagent J），混勻
• 轉移到250微升比色皿或96孔板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 加入xx微升YIJI 酶促液B（Reagent K）
• 加入xx微升YIJI 底色液（Reagent L）
• 上下傾倒數次，混勻 
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為樣品活性讀數

 

• 計算樣品活性

 

比色皿計算

 

 

96孔板計算

 

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，樣品背景測定需平行操作
• YIJI 萃取液A（Reagent E）、YIJI 萃取液C（Reagent G）和YIJI 凈化液（Reagent H）具有揮發性和腐蝕性，注意密閉瓶蓋和操作安全
• 測定值由低到高變化
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本活性測定讀數高于樣品背景測定讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供 YIJI  BCA蛋白質濃度定量試劑盒－YJ 30031.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 用戶可以使用磷脂酶D抑制劑1-丁醇（1-butanol）作為陰性對照或抑制劑陽性對照
• 磷脂酶D單位活性定義為：在30℃，pH 6.5條件下，每分鐘內能夠水解產生1微摩爾磷脂酸所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列磷脂酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

 

使用承諾

上海一基秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。