YIJI植物氫/鉀ATP酶（H^＋/K^＋-ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI植物氫/鉀ATP酶（H^＋/K^＋-ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用氫/鉀ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，通過排除鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶、F型ATP酶以及氫ATP酶干擾的前提下，測定ATP水解產(chǎn)生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以此進(jìn)行測算單位酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等氫/鉀ATP酶或質(zhì)膜型氫ATP酶的特異活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

 

技術(shù)背景

 

腺苷三磷酸酶，又稱為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機(jī)磷。ATP酶的去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細(xì)胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進(jìn)出細(xì)胞。根據(jù)ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能，分為五類不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。F型，又稱為F1F0型，主要在線粒體、葉綠體或細(xì)菌細(xì)胞膜上，進(jìn)行氧化磷酸化或光合作用；P型，又稱為E1E2 型，存在于細(xì)菌和真核細(xì)胞膜和細(xì)胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運(yùn)輸各種化學(xué)分子，包括Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細(xì)菌型等，其中胃氫/鉀ATP酶，一種與胃酸分泌相關(guān)的質(zhì)子泵，屬于這一類型。V型，又稱為V1V0型，主要存在于真核細(xì)胞的液泡（vacuole）中。A型，又稱為A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，為細(xì)胞表面的酶。氫/鉀ATP酶（EC 3.6.1.36）包括胃性、非胃性等。在植物組織細(xì)胞中，氫/鉀ATP酶是P型ATP酶中鉀依賴性氫ATP酶（potassium dependent H^＋ ATPase）或稱質(zhì)膜型氫ATP酶（plasma membrane H^＋ ATPase），達(dá)到氫鉀離子交換。基于底物ATP，通過排除鈉鉀ATP酶（烏本苷；ouabain）、鈣ATP酶（EGTA）、 F型ATP酶（寡霉素；oligomycin）以及V型氫ATP酶（巴佛洛霉素A1；bafilomycin A1）干擾的前提下，受到組織細(xì)胞中的氫鉀ATP酶的水解，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），所產(chǎn)生的峰值變化（340nm），來定量分析氫/鉀ATP酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A）  毫升

YIJI裂解液（Reagent B）       毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）       微升

YIJI反應(yīng)液（Reagent E）            毫升

YIJI底物液（Reagent F）   毫升

YIJI陰性液（Reagent G）     1毫升

產(chǎn)品說明書        1份

 

保存方式

 

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent F）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品準(zhǔn)備（總蛋白制備）

 

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘?jiān)�，重�?fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

二、測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好上述待測樣品，置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)5次（共20分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對(duì)照測定

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)20分鐘

 

• 樣品活性測定

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)20分鐘

 

• 計(jì)算樣品活性

 

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品忌用磷酸緩沖溶液 
• 建議使用植物組織質(zhì)膜樣品；本公司提供的YIJI植物膜性囊泡（RSOV和IOV）制備試劑盒（GMS16021）
• 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測定
• 反應(yīng)測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)20分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘或20分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
• 光譜測定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 氫/鉀ATP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確

 

使用承諾

上海一基秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。