GENMED純化線粒體膜通道孔（MPTP）比色法檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

GENMED純化線粒體膜通道孔（MPTP）比色法檢測試劑是一種旨在通過比色法檢測線粒體的體積（膨脹性）變化，來實時分析和觀察線粒體膜通道孔活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種純化線粒體膜通道孔活性的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，分辨率高，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內外膜成分構成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細胞凋亡或壞死時，線粒體內容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的誘導開放，顯著改變線粒體的通透性，小于1500 D的溶質可以自由進出線粒體。鈣離子過度進入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導致膜通道孔的持續開放，而造成細胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失，觸發細胞凋亡和壞死。而環胞霉素A （cyclosporin A；CsA）、氟比嗪（trifluoperazine）和氯化鎂等則抑制膜通道孔誘導開放。使用分光光度儀（波長540nm或440nm）檢測線粒體的體積（膨脹性）變化，來分析和觀察線粒體膜通道孔開放狀態，即線粒體膜通道孔開放，線粒體容積增大（線粒體膨脹），光散射性降低。 

產品內容

GENMED緩沖液（Reagent A）   5毫升

GENMED誘導液（Reagent B） 200微升

GENMED抑制液（Reagent C） 200微升

產品說明書   1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

比色皿或96孔板：用于線粒體比色分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于線粒體比色定量分析

實驗步驟

實驗開始前，開啟并設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為25℃）：波長540nm或440nm，間隔30秒測讀1次，持續10分鐘至30分鐘，并置零

• 誘導劑檢測

• 準備好待測的純化線粒體樣品
• 移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔板的對應孔里
• 加入170微升室溫預熱的GENMED緩沖液（Reagent A），混勻
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀（波長540nm或440nm）：獲得0分鐘初始讀數（Initial A540）
• 動態測讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
• 即刻加入10微升GENMED誘導液（Reagent B）或用戶自備的待測誘導劑，混勻（注意：可以設定不同濃度梯度）
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀（波長540nm或440nm）：動態記錄10分鐘吸光值變化或設定時間點記錄實際吸光值――吸光值降低，表明誘導膜通道孔開放活性（MPTP）增強，即膜通道孔功能正常
• 計算吸光值比值（A540/Initial A540）：設定時間點實際吸光值/0分鐘吸光值――吸光值比值降低，表明誘導膜通道孔開放活性（MPTP）增強，即膜通道孔功能正常
• 構建膜通道孔誘導開放曲線：縱座標（Y）為實際吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），橫座標（X）為時間（秒）
• 或構建膜通道孔誘導開放-藥物濃度關系曲線：縱座標（Y）為實際吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），橫座標（X）為藥物濃度

• 抑制劑檢測

• 準備好待測的純化線粒體樣品
• 移取20微升線粒體樣品（總量為200微克）到比色皿或96孔板的對應孔里
• 加入160微升室溫預熱的GENMED緩沖液（Reagent A），混勻
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀（波長540nm或440nm）：獲得0分鐘初始讀數（Initial A540）
• 動態測讀1分鐘或室溫下靜置1分鐘
• 加入10微升GENMED抑制液（Reagent C）或用戶自備的待測抑制劑，混勻（注意：可以設定不同濃度梯度）
• 動態測讀2分鐘或室溫下靜置2分鐘
• 即刻加入10微升GENMED誘導液（Reagent B），混勻
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀（波長540nm或440nm）：動態記錄10分鐘吸光值變化或設定時間點記錄實際吸光值――吸光值不變，表明抑制膜通道孔開放活性（MPTP）增強，即膜通道孔功能正常
• 計算吸光值比值（A540/Initial A540）：設定時間實際吸光值/0分鐘吸光值――吸光值比值不變，表明抑制膜通道孔開放活性（MPTP）增強，即膜通道孔功能正常
• 構建膜通道孔誘導開放曲線：縱座標（Y）為實際吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），橫座標（X）為時間（秒）
• 或構建膜通道孔誘導開放-藥物濃度關系曲線：縱座標（Y）為實際吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），橫座標（X）為藥物濃度

注意事項

• 本產品為20次操作
• 本產品用于膜通道孔的功能檢測、以及誘導劑和抑制劑篩選
• 操作時，須戴手套
• 使用時，避免污染母液，尤其是GENMED緩沖液（Reagent A）
• 線粒體樣品中忌用磷酸鹽、EDTA、鈣鎂離子等處理
• 建議使用未經誘導或抑制處理的樣品作為陰性對照
• 可以動態檢測10分鐘或30分鐘  
• 可以使用540nm波長的濾波器或者440nm波長的濾波器
• 可以使用分光光度儀檢測，0.2毫升比色皿替代96孔板
• 540nm波長的0分鐘讀數通常0.8為理想狀態；而440nm波長的0分鐘讀數通常0.2為理想狀態；其吸光讀數取決于線粒體的濃度
• GENMED誘導液（Reagent B）加入后的任一檢測時間讀數低于加入前讀數表明膜通道孔開放
• 如果膜通道孔為瞬時開放（transient），則吸光讀數緩慢降低
• GENMED誘導液（Reagent B）含有氯化鈣，用戶可以使用其它誘導劑替代，例如磷酸鹽，二氧化鉀等
• GENMED抑制液（Reagent C）含有EGTA，用戶可以使用其它抑制劑替代，例如環胞素A，ADP等
• 本公司提供通用型膜通道孔抑制劑：GENMED 0.2毫摩爾環胞素A（cyclosporine A）－GMS12226
• 誘導或抑制再誘導檢測參考圖像如下

• 本公司提供系列線粒體分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感