YIJI動物組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI動物組織氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過使用自由基探針光澤精，捕獲動物細(xì)胞中的活性氧族，使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光，在化學(xué)發(fā)光儀（Luminometer）的幫助下定量檢測動物組織活性氧族（超氧自由基陰離子）的生成和數(shù)量的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物和人體組織的活性氧族的檢測。可以被用于細(xì)胞凋亡、衰老、代謝和營養(yǎng)學(xué)，以及發(fā)育生物學(xué)（男性不育）等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。光澤精（lucigenin），又稱硝酸雙-N-甲基吖啶翁（bis-N-methylacridinium nitrate），是一種帶正電荷的發(fā)光劑，單價還原后生成光澤精自由基，再與超氧自由基陰離子反應(yīng)生成不穩(wěn)定的中間物光澤精二惡二酮，由此分解成電激發(fā)狀態(tài)（N-甲基丫啶酮），通過釋放光子，回復(fù)到基態(tài)。光澤精作為探針，可以特異性檢測組織細(xì)胞超氧自由基陰離子，其發(fā)光強度與超氧自由基陰離子水平成正相關(guān)。 

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）     毫升

YIJI發(fā)光液（Reagent B）     毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存YIJI發(fā)光液（Reagent B） 在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織樣品

超聲儀：用于裂解組織樣品

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

測試管或黑色96孔板：用于發(fā)光檢測用的容器

化學(xué)發(fā)光儀：用于檢測化學(xué)發(fā)光

實驗步驟

• 樣品預(yù)處理

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管（200毫克組織）
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）
• （選擇步驟）小心抽去YIJI清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx毫升YIJI清理液（Reagent A） 
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 強力渦旋震蕩5秒，充分混勻
• （選擇步驟）在冰槽里，置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊5秒
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取1毫升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）移取5微升進(jìn)行蛋白定量測定，并調(diào)整蛋白濃度為20毫克/毫升（注意：建議使用YIJIBradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作（1小時內(nèi)）

• 測讀

測讀開始前，打開化學(xué)發(fā)光儀，設(shè)定儀器內(nèi)溫度為37℃預(yù)熱和整合測讀10秒或15分鐘；然后關(guān)掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴(yán)格置于暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好測試管，做好標(biāo)記：陰性對照、樣品本底和樣品活性
• 移取xx微升YIJI清理液（Reagent A）到陰性對照測試管
• 移取400微升上述預(yù)處理的組織樣品到樣品本底測試管
• 移取400微升上述預(yù)處理的組織樣品到樣品活性測試管
• 分別加入xx微升YIJI發(fā)光液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管
• 輕輕渦旋混勻
• 即刻放進(jìn)37℃化學(xué)發(fā)光儀里測讀
• 整合測讀10秒，獲得相對發(fā)光單位（relative light unit；RLU）
• 或者整合測讀15分鐘，獲得光電子讀數(shù)：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液體閃爍儀替代）
• 計算ROS水平：

注意事項

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 如果測定體系變化，則試劑用量相應(yīng)變化
• 操作時，須戴手套
• 測試前，動物組織須新鮮收集，1小時內(nèi)為最佳
• 組織裂解懸液制備后即刻測讀，不宜過夜保存
• 組織裂解懸液須清澈
• 測讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行
• 根據(jù)活性氧值濃度高低，用戶可以調(diào)整樣品量
• 如果是注射式化學(xué)發(fā)光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學(xué)發(fā)光儀注射（injector）管道
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感