YIJI活體組織氧化應激活性氧（ROS）初級熒光測定試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI活體組織氧化應激活性氧（ROS）初級熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氯熒光乙酰乙酸鹽，在組織氧化損傷條件下，產生熒光，來定量檢測組織內活性氧族的生成和增加的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適宜于活體動物組織的分析。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一種完全自由通過細胞膜的染色劑。一旦被過氧化氫、過氧化基、過氧亞硝基陰離子等氧化，便產生綠色熒光。據此測定組織細胞內活性氧族的濃度。 

產品內容

YIJI清理液（Reagent A）    300毫升

YIJI染色液（Reagent B）      1毫升

YIJI稀釋液（Reagent C）    200毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存YIJI染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

50毫升錐形離心管：用于組織收集的容器

15毫升錐形離心管：用于工作液配制和組織處理的容器

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

6孔細胞培養板：用于組織染色的容器

培養箱或恒溫水槽：用于染色孵育

熒光顯微鏡：用于觀察熒光組織

96孔板：用于熒光檢測的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于組織熒光定量檢測

實驗步驟

方法一：新鮮組織薄片定性檢測

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出25微升YIJI染色液（Reagent B）到新的15毫升錐形離心管，加入2.5毫升YIJI稀釋液（Reagent C)，混勻后，將YIJI染色工作液置入暗室里。然后進行下列操作。

• 手術取出動物組織
• 放進預冷的50毫升錐形離心管
• 加入3毫升YIJI清理液（Reagent A）浸泡15秒
• 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干
• 即刻用刀片切離組織為1cm X 1cm大小的片狀組織
• 用鑷子將組織薄片放進6孔培養板的一個孔
• 加入2.5毫升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的YIJI染色工作液
• 放進37℃培養箱孵育20分鐘，避免光照（注意：如果組織薄片較厚，可以增加孵育時間至60分鐘）
• 小心抽去YIJI染色工作液
• 加入3毫升YIJI清理液（Reagent A）
• 用鑷子將組織薄片放在載玻片上
• 壓片
• 即刻在熒光顯微鏡下觀察（定性檢測）：激發波長490nm，散發波長520nm――綠色熒光增強，表明活性氧族（ROS）含量高

方法二：組織勻漿定量檢測

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。移取990微升YIJI稀釋液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，放進37℃恒溫水槽里預熱，然后加入10微升YIJI染色液（Reagent B），混勻后，將YIJI染色工作液置入暗室里。然后進行下列操作。

• 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量 
• 移取1克組織，放進預冷的50毫升錐形離心管
• 加入3毫升的YIJI清理液（Reagent A）
• 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入5毫升預冷的YIJI稀釋液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（注意：切莫過度勻化）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 置入冰槽里備用
• 移取5微升組織勻漿物進行蛋白定量檢測：建議使用YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒
• 移取50微升組織勻漿物（樣品）或50微升YIJI稀釋液（Reagent C）（背景對照）到1毫升石英比色杯里
• 加入950微升升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的YIJI染色工作液
• 上下傾倒混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：激發波長490nm，散發波長520nm——（樣品RFU-對照RFU）＝實際RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高

方法三：組織勻漿微量檢測

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，移取200微升YIJI稀釋液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，放進37℃恒溫水槽里預熱，然后加入2微升YIJI染色液（Reagent B），混勻后，將YIJI染色工作液置入暗室里。然后進行下列操作。

• 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量 
• 移取200毫克組織，放進預冷的15毫升錐形離心管
• 加入1毫升的YIJI清理液（Reagent A）
• 用鑷子取出組織，用無菌綿紙吸干
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入1毫升預冷的YIJI稀釋液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（注意：約20至40下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 置入冰槽里備用
• 移取5微升組織勻漿物進行蛋白定量檢測：建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒
• 移取50微升組織勻漿物（樣品）或50微升YIJI稀釋液（Reagent C）（背景對照）到96孔板里
• 加入200微升升含有YIJI染色液（Reagent B）和YIJI稀釋液（Reagent C）的YIJI染色工作液
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：激發波長490nm，散發波長520nm——（樣品RFU-對照RFU）＝實際RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項

• 本產品為20次（1克組織）、100次（200毫克組織）、500次（200毫克組織；96孔板）或40次（組織薄片）操作
• 建議使用新鮮組織，手術切除后1小時內的樣品
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，須避免光照
• 如果組織薄片較厚，可以增加孵育時間至60分鐘
• 組織勻漿時，切莫過度
• 建議組織染色完成后，即刻進行熒光定量或定性分析
• 本公司提供陽性對照甲萘醌溶液，觀察組織熒光增強現象
• 本公司提供系列活性氧檢測試劑產品