YIJI石蠟切片組織線粒體DNA萃取試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

 

YIJI石蠟切片組織線粒體DNA萃取試劑是一種旨在使用標(biāo)準(zhǔn)化的化學(xué)脫蠟方法，以及通過物理或化學(xué)破膜及離心處理方法，從從存檔中的石蠟包埋組織切片中分離出完整而純化的線粒體細(xì)胞器，然后進(jìn)一步生物酶處理以獲得高質(zhì)量的線粒體DNA的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于固著在福爾馬林或非交聯(lián)固著劑的各種動物組織線粒體核酸成分的分離。用于后續(xù)的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產(chǎn)品即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，無核酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。

 

技術(shù)背景

 

線粒體細(xì)胞器的研究是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的最重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細(xì)胞凋亡、腫瘤、HIV、老年癡呆癥、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要對象。線粒體DNA的分離和定量以及突變分析是研究中必不可少的。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI脫蠟液（Reagent A）       毫升

YIJI脫水液（Reagent B）  毫升

YIJI強化液（Reagent C）  毫升

YIJI澄清液（Reagent D）  毫升

YIJI清理液（Reagent E）      毫升

YIJI裂解液（Reagent F）      毫升

YIJI凈化液（Reagent G）      毫升

YIJI破膜液（Reagent H）           毫升

YIJI酶解液（Reagent I）      微升

YIJI萃取液（Reagent J）      毫升

YIJI濃縮液（Reagent K）      毫升

YIJI沉淀液（Reagent L）      毫升

YIJI純化液（Reagent M）      毫升

YIJI緩沖液（Reagent N）      毫升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存YIJI凈化液（Reagent G）、YIJI酶解液（Reagent I）、YIJI萃取液（Reagent J）和YIJI濃縮液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

小型染色缸：用于石蠟切片的脫蠟操作

烘箱：用于脫蠟預(yù)處理

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

渦旋震蕩儀：用于混勻

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

 

實驗步驟

 

• 脫蠟處理

 

• 取出10片石蠟包埋的組織切片 
• 放進(jìn)80℃烘箱，孵育30分鐘
• 室溫下靜置15分鐘
• 按下表依次放進(jìn)小染色缸里孵育

 

染色缸	孵育時間
xx毫升YIJI脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
xx毫升YIJI脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
xx毫升YIJI脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
xx毫升YIJI脫水液（Reagent B）	3分鐘
xx毫升YIJI強化液（Reagent C）	3分鐘
xx毫升YIJI澄清液（Reagent D）	3分鐘
xx毫升YIJI清理液（Reagent E）	3分鐘

 

• 小心移去切片上的YIJI清理液（Reagent E）

二、樣品脫蠟處理

1． 用刀片刮下組織樣品

2． 放進(jìn)15毫升錐形離心管

3． 加入xx毫升YIJI脫蠟液（Reagent A）

4． 渦旋震蕩15秒

5． 在室溫下靜置10分鐘

6． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心2分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5810）

7． 小心抽掉上清液

8． 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent E），混勻

9． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心2分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5810）

10． 小心抽掉上清液

11． 重復(fù)實驗步驟8至10二次

• 線粒體分離

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent G）凍融，然后移出xx毫升YIJI凈化液（Reagent G）和xx毫升的YIJI裂解液（Reagent F）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下） 
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf 5810）
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進(jìn)－70℃冰箱里）

 

• DNA萃取

 

• 加入xx微升YIJI破膜液（Reagent H）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘（注意：參見注意事項8）
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent I）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)瞬時離心5秒鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 放進(jìn)58℃恒溫水槽孵育2小時（注意：可以孵育4至16小時，增加萃取產(chǎn)量；參見注意事項8）
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入xx微升YIJI萃取液（Reagent J）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入xx微升YIJI濃縮液（Reagent K）到新的離心管
• 加入xx微升YIJI沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升YIJI純化液（Reagent M）
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入xx微升YIJI緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進(jìn)－20℃冰箱長期保存或移出2微升進(jìn)行PCR反應(yīng)

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為10次（10片10微米厚的組織切片）操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent F） 
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴(yán)格控制操作時間
• 試劑中的溶液使用前搖勻；YIJI酶解液（Reagent I）需放進(jìn)37℃溫育少許；為避免反復(fù)凍融，建議適量分裝
• 通常10片10微米組織切片線粒體含量為10至50微克線粒體蛋白
• 可以通過增加線粒體溶解時間（30分鐘）和酶解時間（直至16小時），獲得大量的DNA產(chǎn)量
• 可以增加切片量，獲得更多線粒體DNA
• 通常10片10微米組織切片提取的線粒體DNA達(dá)1至5微克
• 本公司提供系列線粒體DNA技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定萃取產(chǎn)量和純化程度高
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無基因組DNA污染