YIJI線粒體呼吸鏈復合物V活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI線粒體呼吸鏈復合物V（F0F1-ATP酶/ATP合成酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定與ATP合成對應的ATP水解產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動物、人體、酵母）以及細胞或組織裂解懸液樣品的F0F1-ATP酶/ATP合成酶的特異性活性檢測。可用于心肌、能量代謝、蛋白組學、病理生理學、神經病變等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

 

技術背景

 

線粒體呼吸鏈復合物V，通常稱為ATP合成酶（ATP synthase）、F型ATP酶（F type ATPase）和F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase），是線粒體氧化磷酸化的終極反應。其分子量為500KD，含有十六個亞單位，其中兩個：ATP酶6和8為線粒體DNA編碼的。ATP酶主要有兩個結構域：F0為質子通道，由幾個膜蛋白構成，包括a、b、c、d、e、F6、A6L、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和F1催化活性結構域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。復合物V的主要功能在于產生大部分細胞所需的能量ATP。ATP的合成需要線粒體內膜電子傳遞到氧分子時，呼吸鏈蛋白所產生的質子梯度變化。質子通過F0結構域傳遞到基質，激活F1催化活性結構域，促使ATP合成。該酶異常會導致心肌和神經系統疾病。基于ATP，在寡霉素參與下，受到F1F0 ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析F1F0 ATP酶活性。其反應系統為：

 

F1F0 ATPase

 ATP   =    ADP  +  Pi

 

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

         

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

  （高吸收峰） （低吸收峰）

 

產品內容

 

YIJI緩沖液（Reagent A）  20毫升

YIJI反應液（Reagent B）      2.5毫升

YIJI陰性液（Reagent C）     2毫升

YIJI底物液（Reagent D） 500微升

YIJI專性液（Reagent E）   250微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；YIJI反應液（Reagent B），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

培養箱：用于孵育反應物

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI反應液（Reagent B）注意避光。然后進行下列操作。

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔30秒，讀數11次（共5分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取780微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升YIJI反應液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI底物液（Reagent D）
• 放進30℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入100微升YIJI陰性液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數1分鐘或5分鐘

 

• 樣品總活性測定

 

• 移取780微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升YIJI反應液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI底物液（Reagent D）
• 放進30℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數1分鐘或5分鐘

 

• 樣品非特異活性測定

 

實驗開始前，移取100微升待測樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）到1.5毫升離心管，加入20微升YIJI專性液（Reagent E），混勻后，放進30℃培養箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

 

• 移取760微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升YIJI反應液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI底物液（Reagent D）
• 放進30℃培養箱里孵育3分鐘
• 加入120微升上述預處理的待測樣品
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數1分鐘或5分鐘

 

• 計算樣品活性

 

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

 

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數 X 1或5（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

2）樣品特異活性

 

樣品總活性測定－樣品非特異活性測定＝樣品特異活性

 

注意事項

 

• 本產品為21次操作（10個樣本），包括1次背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 線粒體樣品檢測前，建議凍存融解（－70℃至37℃）循環3次
• 如果增強酶活檢測，建議使用YIJI線粒體復合物待測樣品預處理試劑盒－YJ10342
• 建議線粒體懸液使用0.25 M SUCROSE和2 mM EDTA，pH9.0；忌用磷酸緩沖溶液
• 建議使用線粒體裂解懸液，而不是細胞裂解懸液。如果使用細胞裂解懸液，第一須澄清；第二須加50微克
• 加入樣品后3秒內即刻光譜測定
• 反應1分鐘后光譜測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；測定可以持續5分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于1分鐘或5分鐘測定讀數，表明有酶活性
• 光譜測定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測樣本線粒體蛋白濃度為10微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供YIJI線粒體溶解試劑盒YJ10018為后續的線粒體蛋白濃度測定的預處理試劑盒和YIJI Bradford蛋白質濃度定量試劑盒YJ30030.1）
• 樣品特異活性是指寡霉素敏感的ATP合成酶，去除其它干擾因素（例如復合物I/II/III/IV等）
• 線粒體呼吸鏈復合物V酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列線粒體及其酶類技術產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確