人體p16基因甲基化檢測試劑盒產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

YIJI人體p16基因甲基化檢測試劑是一種旨在通過化學方法使基因組中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）轉變成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，經過甲基化特異性PCR擴增，探測到人體腫瘤抑制基因p16啟動子  島甲基化信息的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。可以被用于人體腫瘤抑制基因p16相關的腫瘤表觀遺傳學研究。產品即到即用，性能穩定，操作簡便，轉化保證。

 

技術背景

 

在基因的啟動子區域（promotor region）通常存在一些富含重復雙核苷酸“”的區域，稱為“島”（ island）。在人類基因組內，存在有近3萬個島。這些島不僅是基因的一種標志，而且還參與基因表達的調控和影響染色質的結構，更是DNA甲基化的唯一位置。島甲基化形態的掃描分析是基因表達和表觀基因組學的主要課題。p16基因，又稱為細胞周期素依賴性激酶抑制劑2A（Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A）或  ，是人體腫瘤抑制基因之一。其功能在于抑制CDK4激酶的活性，調節細胞周期。由于RNA剪切，p16具有三種轉錄體：  。一旦突變或甲基化，會造成細胞繁殖調控機制缺失，而致腫瘤或細胞衰老等。

 

產品內容

 

YIJI緩沖液（Reagent A）      毫升

YIJI變性液（Reagent B） 微升

YIJI處理液（Reagent C） 毫升

YIJI轉化液（Reagent D） 毫升

YIJI封隔液（Reagent E） 毫升

YIJI凈化液（Reagent F） 毫升

YIJI萃取液（Reagent G）   毫升

YIJI濃縮液（Reagent H） 毫升

YIJI助沉液（Reagent I） 微升

YIJI沉淀液（Reagent J） 毫升

YIJI清理液（Reagent K）   毫升

YIJI保存液（Reagent L） 毫升

YIJI擴增液（Reagent M） 微升

YIJI補充液（Reagent N） 毫升

YIJI U引物F（Reagent O） 微升

YIJI U引物R（Reagent P） 微升

YIJI M引物F（Reagent Q） 微升

YIJI M引物R（Reagent R） 微升

YIJI針筒離心柱 套

產品說明書 1份

保存方式

 

保存YIJI處理液（Reagent C）、YIJI轉化液（Reagent D）、YIJI助沉液（Reagent I）、YIJI擴增液（Reagent M）、YIJI補充液（Reagent N）、YIJI U引物F（Reagent O）、YIJI U引物R（Reagent P）、YIJI M引物F（Reagent Q）和YIJI M引物R（Reagent R）在－20℃冰箱里；YIJI凈化液（Reagent F）和YIJI針筒離心柱保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI處理液（Reagent C）和YIJI轉化液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應物

微型臺式離心機：用于沉淀樣品或去除雜質

渦旋震蕩儀：用于混勻反應物

真空泵：用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞：用于去除樣品中的液體成分

PCR儀：用于樣品擴增

PCR管或平板：用于PCR反應的容器

測序試劑盒：用于測序前的產物處理

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將YIJI處理液（Reagent C）和YIJI轉化液（Reagent D）從－20℃冰箱中取出，置入室溫下。同時將其中一管YIJI緩沖液（Reagent A）置入65℃恒溫水槽中預熱備用。然后進行下列操作：

 

• 轉化實驗

 

• 準備1個2.0毫升離心管
• 加入2微克DNA樣品
• 加入適量的YIJI緩沖液（Reagent A）到50微升反應體系（注意：不要使用65℃預熱的YIJI緩沖液（Reagent A））
• 加入xx微升YIJI變性液（Reagent B），混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入xx微升YIJI處理液（Reagent C）（注意：可見溶液呈現黃色）
• 在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒，充分混勻
• 加入xx微升YIJI轉化液（Reagent D），上下傾倒混勻
• 加入xx微升YIJI封隔液（Reagent E）
• 放進55℃恒溫水槽孵育16小時
• 小心抽去xx微升YIJI封隔液（Reagent E）
• 加入xx毫升充分搖勻的YIJI凈化液（Reagent F），上下傾倒混勻
• 移入到針筒離心柱
• 連接到真空泵，將柱內液體抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內液體）
• 加入xx毫升YIJI萃取液（Reagent G）
• 運用真空泵，將YIJI萃取液（Reagent G）抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內液體）
• 重復實驗步驟15至16一次
• 去掉針筒，將離心柱放在1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入xx微升65℃預熱的YIJI緩沖液（Reagent A）到離心柱
• 室溫下靜置1分鐘
• 放進微型臺式離心機離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉離心柱
• 加入xx微升YIJI變性液（Reagent B）到離心管，混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入xx微升YIJI濃縮液（Reagent H）
• 加入xx微升YIJI助沉液（Reagent I）
• 加入xx微升YIJI沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent K）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入xx微升YIJI保存液（Reagent L）
• 放進－20℃冰箱長期保存

 

二、甲基化特異性PCR

 

• 將YIJI擴增液（Reagent M）、YIJI補充液（Reagent N）、YIJI U引物F（Reagent O）、YIJI U引物R（Reagent P）、YIJI M引物F（Reagent Q）和YIJI M引物R（Reagent R）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對一個樣本，準備2個PCR管，分別標記為U和M管
• 分別移出xx微升YIJI擴增液（Reagent M）到PCR管里
• 分別加入1微升上述轉化實驗中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入xx微升YIJI U引物F（Reagent O）和YIJI U引物R（Reagent P）到U管中
• 分別加入xx微升YIJI M引物F（Reagent Q）和YIJI M引物R（Reagent R）到M管中
• 再分別加入xx微升YIJI補充液（Reagent N）（反應總量為25微升）
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項9）
• 即刻進行熱啟動PCR反應：

 

溫度（℃）	時間	循環
95	9分鐘	1
95 61/65 72	30秒 30秒 30秒	35
72	5分鐘	1

 

• 反應完畢后，移取5微升進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳
• 陽性條帶：轉化后非甲基型（U）――151 bp；轉化后甲基型（M）――150 bp

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 一個特定基因的甲基化特異性PCR通常包括：轉化后甲基型（M）、轉化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設計原則： 
• YIJI U引物F（Reagent O）、YIJI U引物R（Reagent P）、YIJI M引物F（Reagent Q）和YIJI M引物R（Reagent R）的信息如下：

 

引物名稱	序列	Tm（℃）	GeneID	片段
YIJI M引物F（Reagent Q）
YIJI M引物R（Reagent R）
YIJI U引物F（Reagent O）
YIJI U引物R（Reagent P）

 

• 通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測PCR擴增后的結果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產生擴增產物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴增

         

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現“U”和“M”同時呈現陽性；建議使用YIJI基因甲基化程度定量分析試劑盒（GMS20024.3）予以分析
• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 必要時，可以調整Tm溫度 
• 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 轉化后的DNA保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融
• 本公司同時提供系列基因甲基化分析試劑產品
• 本公司提供系列甲基化分析試劑產品

 

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定轉化保證
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定反應產量高