細(xì)胞無機(jī)磷/游離磷酸根離子比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 細(xì)胞無機(jī)磷/游離磷酸根離子比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用硫酸亞鐵氨，在酸性環(huán)境下，與游離磷酸根反應(yīng)，還原產(chǎn)生顯色產(chǎn)物鉬藍(lán)，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法測(cè)定離子濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞裂解懸液樣品的無機(jī)磷/游離磷酸根離子的檢測(cè)。可應(yīng)用于細(xì)胞酶學(xué)、結(jié)合蛋白成分等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

無機(jī)磷/游離磷酸根離子（Phosphate；PO4^-3）作為游離離子存在于水資源系統(tǒng)；作為鹽類分子存在于陸地環(huán)境中、巖礦床上等。由于磷酸根離子沒有和生物分子整合，故成為無機(jī)磷（inorganic phosphate）。無機(jī)磷是陸地和水生植物生長(zhǎng)的三大主要營(yíng)養(yǎng)元素之一，常用于肥料促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)和發(fā)育，也是藻類爆發(fā)的原因之一。同時(shí)可以用于水質(zhì)軟化劑（water softener）。無機(jī)磷/游離磷酸根離子水平檢測(cè)成為水質(zhì)和環(huán)境健康監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。在生物體系中，磷作為骨和牙組織的結(jié)構(gòu)元素，也是生物能量分子例如ATP、ADP、AMP等，以及體內(nèi)磷酸化酶底物的基本元素。通過檢測(cè)游離磷酸根水平，反映生物體的磷酸化狀況等。基于游離磷酸根離子，在酸性環(huán)境下，與硫酸亞鐵氨反應(yīng)，還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色產(chǎn)物，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，來定量測(cè)定無機(jī)磷/游離磷酸根離子濃度。  

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI 清理液（Reagent A） 毫升

YIJI 裂解液（Reagent B） 毫升

YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升

YIJI顯色液（Reagent D） 毫升

YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） 微升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存YIJI 裂解液（Reagent B）和YIJI顯色液（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI顯色液（Reagent D）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品收集

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞 
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取2微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

二、測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）
• 設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)為660nm，并置零  
• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 按下表分別加入YIJI緩沖液（Reagent C）和YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到每個(gè)離心管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

管號(hào)	YIJI緩沖液（Reagent C）	YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）	測(cè)定體系標(biāo)準(zhǔn)磷濃度
1	xx微升	xx微升	xx微摩爾/升
2	xx微升	xx微升	xx微摩爾/升
3	xx微升	xx微升	x微摩爾/升
4	xx微升	xx微升	xx微摩爾/升
5	xx微升	0	0

 

 

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

 

• 移取200微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI 顯色液（Reagent D），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至4四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品測(cè)定

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白） 
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent D），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度

 

• 計(jì)算樣品活性

 

 

七、酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品、待測(cè)樣品
• 分別移取100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里
• 移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到待測(cè)樣品孔里
• 加入10微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）到待測(cè)樣品孔里
• 分別加入xx微升YIJI顯色液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)磷濃度
• 計(jì)算樣品活性

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和40次（酶標(biāo)板）操作
• 本產(chǎn)品檢測(cè)范圍為20微摩爾以上
• 操作時(shí)，須戴手套
• YIJI 顯色液（Reagent D）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
• 樣品切忌使用磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 如果用戶沒有660nm波長(zhǎng)，可以使用600至660nm的任一波長(zhǎng)替代
• 吸光讀數(shù)增高，表明具有無機(jī)磷/游離磷酸根離子
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本無機(jī)磷/游離磷酸根離子濃度過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供YIJI  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 本公司提供系列離子檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確

 

使用承諾

 

上海一基秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。