細胞 PKG 激酶總活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 細胞 PKG 激酶總活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到 PKG 磷酸化后，進而由

丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生 ADP 過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷

酸（NADH）的氧化反應， 即采用比色法測定其氧化后峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中 PKG 總活性

的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃

取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中 PKG 激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。

產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。

技術背景

蛋白激酶G（protein kinase G；PKG；EC2.7.11.12），又稱為cGMP依賴性蛋白激酶（cGMP dependent protein

kinase；cGK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一，從單細胞生物草履

蟲（Paramecium）到人體高度進化保留的激酶。哺乳動物有2個亞型，I型和II型，其中I型有2個異構體Iα

和Iβ。I型和II型結構均為同源雙體，分別為75KD和85KD，其中包括調節結構域（cGMP結合位點）、催化

結構域（磷酸化目標蛋白）和N末端結構域（底物結合）等。I型分布在細胞漿，而II型分布在質膜上。I型

在平滑肌和血小板高度表達，而II型在腎、腸等組織細胞高度表達。PKG受到cGMP的作用，而被激活。其

功能在于調節平滑肌松弛、血小板功能、血壓、精子細胞代謝，細胞分裂，核酸合成，一氧化氮反應等。

其磷酸化目標序列為

。基于底物

，在ATP的存在下，受到PKG的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，

進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還

原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌

呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析蛋白激酶G

的總活性。其反應方式為：

產品內容

YIJI 清理液（Reagent A）

YIJI 裂解液（Reagent B）

YIJI 緩沖液（Reagent C）

YIJI 酶促液（Reagent D）

YIJI 反應液（Reagent E）

YIJI 底物液（Reagent F）

YIJI 陰性液（Reagent G）

產品說明書

毫升

毫升

毫升

微升

微升

微升

微升

1份

保存方式

保存 YIJI 清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍

融；有效保證 6 月

1

用戶自備

PKG 激酶：用于抑制劑篩選

1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

比色皿或酶標板：用于比色分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品比色分析

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1． 準備好 25cm2 細胞培養瓶或 60mm 細胞培養皿的待測培養細胞（1 至 5 X 106 細胞）

2． 小心加入

毫升 YIJI 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入

毫升 YIJI 清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入

微升 YIJI 裂解液（Reagent B），充分混勻

10．轉移到預冷的 1.5 毫升離心管

11．強力渦旋震蕩 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分鐘

13．放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的預冷的 1.5 毫升離心管

15．移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 YIJI Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－

YJ30030.1）

16．即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里

2． 設定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 1 分鐘，讀數 6 次（共 5 分鐘），并置零

三、 背景對照測定

1． 移取

2． 加入

3． 加入

微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

微升 YIJI 酶促液（Reagent D）

微升 YIJI 陰性液（Reagent G）

4． 放進 30℃培養箱里靜置 2 分鐘

2

5． （選擇步驟）放進分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

7． 加入

8． 加入

微升 YIJI 反應液（Reagent E）

微升 YIJI 底物液（Reagent F）

9． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

10．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 5 分鐘

四、 樣品測定

1． 移取

2． 加入

微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

微升 YIJI 酶促液（Reagent D）

3． 加入 5 微升待測樣品（注意：50 微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）

4． 放進 30℃培養箱里靜置 2 分鐘

5． （選擇步驟）放進分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

7． 加入

8． 加入

微升 YIJI 反應液（Reagent E）

微升 YIJI 底物液（Reagent F）

9． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

10．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 5 分鐘

五、 計算樣品活性

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

六、酶標板測定

1． 在 96 孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取

3． 分別加入

4． 分別加入

微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中

微升 YIJI 酶促液（Reagent D）

微升 YIJI 陰性液（Reagent G）或待測樣品（50 微克細胞裂解懸液蛋白）到相應

孔中（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動 96 孔酶標板

6． 在 30℃溫度下孵育 2 分鐘

7． 分別加入

8． 分別加入

微升 YIJI 反應液（Reagent E）

微升 YIJI 底物液（Reagent F）

9． 輕輕搖動酶標板

10．即刻放進酶標儀檢測：0 分鐘讀數和 5 分鐘讀數

11．活性計算：

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

3

七、抑制劑篩選

1． 在 96 孔酶標板上做好相應標記：背景、零抑制、完全抑制和待測抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑

內容物

樣本背景

零抑制對照

（0％抑制）

YIJI 緩沖液

（Reagent C）

YIJI 酶促液

（Reagent D）

待測抑制劑

用戶自備的純化酶

96 孔板每孔總量

（

微升

微升

背景孔

微升）

――

微升

零抑制孔

（

微升）

――

――

完全抑制孔

（

微升）

微升

微升

待測抑制劑樣品

（

微升）

微升

微升

微升

微升

微升

微升

完全抑制對照

（100％抑制）

微升

微升

待測抑制活性

3． 輕輕搖動酶標板，混勻

4． 放進 30℃培養箱里靜置 5 分鐘

5． 分別加入

6． 分別加入

微升 YIJI 反應液（Reagent E）

微升 YIJI 底物液（Reagent F）（注意：除樣本背景孔外）

7． 輕輕搖動酶標板

8． 放進 30℃培養箱里孵育 30 分鐘

9． 即刻放進酶標儀檢測

10．獲得吸光讀數（OD）

11．抑制活性計算：

1）

2） IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度

3） 直接構建抑制曲線：縱座標（Y 軸）為吸光讀數 OD；橫座標（X 軸）為已知抑制劑濃度

注意事項

1． 本產品為 25 次操作，包括背景操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需 1 次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關重要

6． 加入 YIJI 底物液（Reagent F）后 3 秒內即刻比色測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續 30 分鐘

8． 比色測定后，比色皿須清洗徹底

9． 樣本測定 0 分鐘讀數高于 5 分鐘讀數表明具有酶活性

10．建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供 YIJI Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－

YJ30030.1）

11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

4

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