植物氫ATP酶（H －ATPase）總活性酶連續反應光譜法定量檢測試劑盒

           產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 植物氫ATP酶（H＋-ATPase）總活性酶連續反應光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用氫ATP酶、丙

酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，在排除其它ATP酶干擾的情況下，受到氫ATP酶的水解產生的

ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后吸

光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、

成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、

上胚軸（epicotyl）等H＋-ATP酶的特異性活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡

捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

氫ATP酶（H＋-ATPase；EC3.6.3.6），又稱為質子或氫離子轉位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生

物能量傳導過程中起著重要作用。其分成三類：質膜型（plasma membrane type或P型） 真細菌型、（eubacterial

type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。質膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的質膜上，約

100kd蛋白；真細菌型存在于葉綠體、線粒體和細菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成；囊/液泡

型存在于真核生物細胞器的囊泡系統。其中植物質膜氫ATP酶，100kd分子量，是植物細胞膜上重要的功能

酶，為植物生命活動的主要酶之一。液泡型氫ATP酶是V型ATP酶的主要成員，400 至 600kd，含有胞漿復

合體（V1）和胞膜復合體（V0），通過產生電子泵，轉移質子，是微粒體和溶酶體酸性化，同時提供次級

活性轉運體的動力。氫ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。這一去磷酸化反應釋放出能量，

成為細胞生命代謝的能源。同時利用細胞內ATP釋放的能量逆向跨質膜把質子轉運出細胞，產生并保持細

胞膜或細胞器兩側氫離子的電化學梯度，為一系列次級轉運體和通道蛋白對各種營養物質及離子的跨質膜

轉運提供能量。植物氫ATP酶還參與細胞內pH水平、細胞伸長、氣孔開閉、以及植物對環境的應激反應等

多種生理過程的調節。基于底物ATP，在排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）

和氫鉀（奧美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干擾下，受到氫ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate

kinase； 和乳酸脫氫酶PK）（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced

nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine

dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析氫ATP酶的特異活性。其反應系統為：

H＋-ATPase

ATP +

H2O

→

ADP +

Pi

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate +

ADP

→

pyruvate + ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate +

NADH

（高吸收峰）

→

lactate

+ NAD+

（低吸收峰）

產品內容

YIJI  清理液（Reagent A）

YIJI  裂解液（Reagent B）

YIJI  緩沖液（Reagent C）

YIJI  酶促液（Reagent D）

YIJI  反應液（Reagent E）

YIJI  底物液（Reagent F）

YIJI  陰性液（Reagent G）

產品說明書

毫升

毫升

毫升

微升

毫升

毫升

毫升

1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；YIJI  底物液（Reagent F），避免光照，有效保證 6 月

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于反應孵育

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI  底物液（Reagent F）注

意避光；YIJI  緩沖液（Reagent C）室溫下預熱。然后進行下列操作。

一、 樣品準備

1． 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定組織重量

2． （選擇步驟）放進預冷的 15 毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入適量的（1 克組織需要 xx 毫升）YIJI  清理液（Reagent A）清洗 1 次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進一個預冷的 15 毫升錐形離心管

6． 加入預冷的 xx 毫升 YIJI  裂解液（Reagent B）

7． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

8． 即刻放進預冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約 80 下）

9． 將所有組織勻漿物移入 1.5 毫升離心管，放進 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 5000g（或

7500RPM，例如 eppendorf 5415）

10．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的 15 毫升錐形離心管

11．（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心 5 分鐘一次，速度為 5000g（或 7500RPM，

例如 eppendorf 5415）

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12．即刻移入到 1.5 毫升離心管

13．移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 YIJI  Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－

GMS30030.1）

14．放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、測定準備

1． 準備好待測樣品（例如植物組織裂解樣品等），置于冰槽里

2． 設定好分光光度儀（溫度為 37℃）：波長為 340nm，間隔 5 分鐘，讀數 7 次（共 30 分鐘），并置零

三、 背景對照測定

1． 移取 xx 微升 YIJI  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI  酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI  反應液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升 YIJI  底物液（Reagent F）

5． 放進 37℃培養箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 xx 微升 YIJI  陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 30 分鐘

四、 樣品活性測定

1． 移取 xx 微升 YIJI  緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI  酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI  反應液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升 YIJI  底物液（Reagent F）

5． 放進 37℃培養箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 50 微升待測樣品（注意：100 微克總蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在 3 秒之內）

8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340 波長讀數 0 分鐘 －340 波長讀數 30 分鐘

五、 計算樣品活性

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩

爾吸光系數）X 10 或 30（反應時間，分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

或者

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數]÷[0.1（樣品重量；毫克）X 6.22（毫摩

爾吸光系數）X 10 或 30（反應時間，分鐘）]＝單位/毫克

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

注意事項

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