組織GSK3β激酶活性光譜法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

 

主要用途

 

YIJI 組織GSK3β激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物，在GSK3α抑制劑的存在下，受到GSK3β磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中GSK3β特異活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中GSK3β激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。

 

技術背景

 

糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3；GSK3；EC 2.7.11.26）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其目標蛋白為糖原合成酶和活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T lymphocytes；NFAT），進行磷酸化后，抑制其功能，同時調控細胞對DNA損傷的反應、生物發育的組織排列（tissue patterning）、蛋白合成、細胞分化和繁殖等。糖原合成酶激酶3從酵母到人體高度進化保留，果蠅中GSK3同源蛋白為Shaggy（Zeste White 3），在Wnt信號通路中磷酸化β-catenin，導致后者泛素化后降解，防止β-catenin進入細胞核激活轉錄因子。糖原合成酶激酶3本身受到胰島素、生長因子、蛋白激酶B（protein kinase B）/v-akt鼠源胸腺瘤病毒腫瘤基因同源體（akt）調控。糖原合成酶激酶3分成兩種異構體：糖原合成酶激酶3α和β，其結構相似，功能不同。糖原合成酶激酶3β與tau蛋白磷酸化、能量代謝、神經細胞發育、機體形狀構成等有關。糖原合成酶激酶3β功能異常將導致阿茲罕默綜合征等疾病。其磷酸化目標序列為GPHRSTPESRAAV。基于底物GPHRSTPESRAAV，在ATP和GSK3α抑制劑Aloisine A的存在下，受到GSK3β激酶的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析糖原合成酶激酶3β的特異活性。其反應方式為：

 

產品內容

 

YIJI 清理液（Reagent A）  毫升

YIJI 裂解液（Reagent B）  毫升

YIJI 緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI 酶促液（Reagent D）       微升

YIJI 反應液（Reagent E）       微升

YIJI 底物液（Reagent F）  微升

YIJI 陰性液（Reagent G）       微升

產品說明書   1份

 

保存方式

 

保存YIJI  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

GSK3β激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

（微型）臺式離心機：用于組織預處理

比色皿或酶標板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光譜分析

 

實驗步驟

 

• 待測樣品準備

 

• 手術取出動物組織，并秤重500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI 清理液（Reagent A）清洗
• （選擇步驟）抽去清理液
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx微升YIJI 裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
• 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YJ0030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

 

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數6次（共5分鐘），并置零
• YIJI  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI 酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI 反應液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI 底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升YIJI 陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘

 

• 樣品測定

 

• 移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI 酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI 反應液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI 底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數5分鐘

 

• 計算樣品活性

 

 

• 酶標板測定

 

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 分別加入xx微升YIJI 酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI D反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI D底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔酶標板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI D陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動酶標板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 活性計算：

 

七、抑制劑篩選

 

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進行樣品預處理

 

內容物	空背景對照	樣本背景	完全酶活性	待測抑制劑酶活性
YIJI  緩沖液（Reagent C）	xx微升	xx微升	xx微升	xx微升
YIJI 陰性液（Reagent G）	xx微升	xx微升	xx微升	——
待測抑制劑	——	xx微升	――	xx微升
用戶自備的純化酶	——	——	xx微升（1毫單位）	xx微升（1毫單位）
96孔板每孔總量	空背景對照孔 （xx微升）	樣本背景孔 （xx微升）	完全活性孔 （xx微升）	待測抑制劑樣品孔 （xx微升）
輕輕搖動酶標板，混勻，放進30℃培養箱里孵育30分鐘。然后進行下列操作

 

• 分別移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx YIJI 酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI 反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI 底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動酶標板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 即刻放進30℃酶標儀檢測：測讀30分鐘
• 抑制活性計算：

 

 

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作，包括背景操作
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
• 樣品須澄清，至關重要 
• 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光譜測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續30分鐘
• 光譜測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 可以使用GSK3β抑制劑噻二唑烷酮-8（thiadiazolidinone-8；TDZD-8）作為抑制劑對照或陰性對照
• 糖原合成酶激酶3β活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

 

使用承諾

 

上海一基秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。