非突觸體腦組織線粒體分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI非突觸體腦組織線粒體分離試劑是一種旨在從腦組織中分離出活性完整而高度純化的非突觸體線粒體細(xì)胞器的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種腦組織（人體和動(dòng)物）的活性線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，活性保存，純度可達(dá)99％。可以被用于線粒體酶活性、細(xì)胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的最常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：第一，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘?jiān)�碎屑和巨大�?xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。動(dòng)物腦組織中，包括前腦部位的腦皮層（cortex）或腦紋體（striatum）往往存在著非突觸體（non-synaptosome）和包含有髓軸突纖維（髓鞘；Myelin）和神經(jīng)末梢（突觸體；synaptosome），結(jié)構(gòu)的異源性導(dǎo)致細(xì)胞線粒體的生物學(xué)特征的差異，純化游離的腦組織線粒體（非突觸體腦組織線粒體）是必需的。

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   200毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    20毫升

YIJI凈化液（Reagent C）     5毫升

YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）     3毫升

YIJI保存液（Reagent E）    80毫升

YIJI高純液A（Reagent F）    20毫升

YIJI高純液B（Reagent G）    20毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存YIJI凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI高純液A（Reagent F）和YIJI高純液B（Reagent G），避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

3毫升針筒和18號針頭：用于抽取線粒體樣品帶

4℃（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

4℃超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分和高質(zhì)純化

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

• 組織勻漿法

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）凍融，然后移出500微升YIJI凈化液（Reagent C）到2毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 手術(shù)取出動(dòng)物腦組織（腦皮層），并秤重以確定500毫克腦組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)） 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗2次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的2.5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約20下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放入4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的組織細(xì)胞
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取2毫升YIJI離心液A（Reagent F）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液A（Reagent F））
• 輕輕加入2毫升的YIJI離心液B（Reagent G）在YIJI離心液A（Reagent F）上面，不要攪動(dòng)YIJI離心液A（Reagent F）（注意：使用前搖勻YIJI高純液B（Reagent G））
• 輕輕加入2毫升組織上清液在YIJI高純液B（Reagent G）的上面，避免震動(dòng)
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心45分鐘，速度為32000g
• 小心取出超速離心管：可見下層致密的棕色或乳黃色樣品帶（YIJI離心液A（Reagent F）和YIJI離心液B（Reagent G）的交界處）；可見中層為髓鞘和突觸體樣品帶以及上層少量細(xì)胞膜和細(xì)胞核樣品帶 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純非突觸體線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（13000RPM，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟20至22一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

• 化學(xué)處理法

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）凍融，然后移出500微升YIJI凈化液（Reagent C）到2毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 手術(shù)取出動(dòng)物腦組織（腦皮層），并秤重以確定500毫克腦組織重量（實(shí)驗(yàn)前最好使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)） 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗2次
• 移入一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的2.5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預(yù)冷的250微升YIJI強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次
• 加入預(yù)冷的2.5毫升YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放入4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取2毫升YIJI離心液A（Reagent F）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液A（Reagent F））
• 輕輕加入2毫升的YIJI離心液B（Reagent G）在YIJI離心液A（Reagent F）上面，不要攪動(dòng)YIJI離心液A（Reagent F）（注意：使用前搖勻YIJI高純液B（Reagent G））
• 輕輕加入2毫升組織上清液在YIJI高純液B（Reagent G）的上面，避免震動(dòng)
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心45分鐘，速度為32000g
• 小心取出超速離心管：可見下層致密的棕色或乳黃色樣品帶（YIJI離心液A（Reagent F）和YIJI離心液B（Reagent G）的交界處）；可見中層為髓鞘和突觸體樣品帶以及上層少量細(xì)胞膜和細(xì)胞核樣品帶 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純非突觸體線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液(Reagent E)
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（13000RPM，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟25至27一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為10次操作（500毫克動(dòng)物腦組織/次）操作
• 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行
• 建議使用足夠的組織
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常500毫克腦組織的線粒體含量為25微克線粒體蛋白

6． 如果需要計(jì)量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

7． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度（可達(dá)到99％）和產(chǎn)量最為理想

8． 使用YIJI高純液A（Reagent F）和YIJI高純液A（Reagent G）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液

9． 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整YIJI高純液A（Reagent F）和YIJI高純液A（Reagent G）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿

• 線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細(xì)胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內(nèi)外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列線粒體試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的非突觸體腦組織線粒體純度達(dá)99％