植物高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI植物高質(zhì)純化線粒體分離試劑是一種旨在從植物細(xì)胞或組織中分離出完整而高度純化的活性線粒體細(xì)胞器的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）、以及培養(yǎng)細(xì)胞的高純線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，純度可達(dá)99％�？梢员挥糜诰�粒體酶活性、細(xì)胞凋亡、信號傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱國際同類產(chǎn)品最佳。

 

技術(shù)背景

 

線粒體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的最常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離線粒體的技術(shù)方法基本上采用：第一，通過機械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細(xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液（Reagent A）   100毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    40毫升

YIJI凈化液（Reagent C）    10毫升

YIJI活性液（Reagent D）   200微升

YIJI強化液（Reagent E）     5毫升

YIJI保存液（Reagent F）   100毫升

YIJI高純液（Reagent G）    55毫升

產(chǎn)品說明書 1份

 

保存方式

 

保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，YIJI高純液（Reagent G），避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于細(xì)胞或組織收集后離心或清洗的容器

1.5毫升離心管：用于保存線粒體的容器

4℃臺式離心機：用于沉淀細(xì)胞

4℃超速離心機：用于分離細(xì)胞器成分和高質(zhì)純化

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

 

 

實驗步驟

 

一、植物組織線粒體分離（組織勻漿法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移取20微升YIJI活性液（Reagent D）、 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿幫勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項9）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管，放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細(xì)胞壁、淀粉顆粒、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞以及完整質(zhì)體等殘渣
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實驗步驟21至23一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

二、植物組織線粒體分離（化學(xué)處理法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移取20微升YIJI活性液（Reagent D）、 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預(yù)冷的500微升YIJI強化液（Reagent E）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項10）
• 加入預(yù)冷的5毫升YIJI保存液（Reagent F），輕輕搖動試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細(xì)胞壁、淀粉顆粒、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞以及完整質(zhì)體等殘渣
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實驗步驟27至29一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

 

 

三、植物細(xì)胞或原生質(zhì)體線粒體分離（細(xì)胞勻漿法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移取20微升YIJI活性液（Reagent D）、 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備5 X 10⁷植物細(xì)胞或原生質(zhì)體
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞（約80下）（注意：參見注意事項9）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管，放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細(xì)胞壁、淀粉顆粒、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞以及完整質(zhì)體等殘渣
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實驗步驟23至25一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

四、植物細(xì)胞或原生質(zhì)體線粒體分離（化學(xué)處理法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移取20微升YIJI活性液（Reagent D）、 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）和4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為YIJI裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備5 X 10⁷植物細(xì)胞或原生質(zhì)體
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的5毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• （選擇步驟）超聲波處理1分鐘
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預(yù)冷的500微升YIJI強化液（Reagent E）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項10）
• 加入預(yù)冷的5毫升YIJI保存液（Reagent F），輕輕搖動試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細(xì)胞壁、淀粉顆粒、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞以及完整質(zhì)體等殘渣
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品帶
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復(fù)實驗步驟28至30一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 即刻移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

 

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為10次操作（1克植物組織或5 X 10⁷細(xì)胞）
• 實際操作的植物組織重量或細(xì)胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如200毫克植物組織：試劑用量是標(biāo)準(zhǔn)用量的五分之一
• 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行
• 操作時，須戴手套
• 建議無菌操作，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的組織或細(xì)胞量
• 建議植物組織使用組織勻漿器操作；德國的BRAUN細(xì)胞勻漿器最為理想
• 建議嚴(yán)格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為80下（或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• YIJI裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚類物質(zhì)的作用
• 建議使用40000g以上離心速度；如果沒有條件，則不能低于30000g，離心時間增加為60至90分鐘

13． 使用YIJI高純液（Reagent G）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液

• 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整YIJI高純液（Reagent G）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 不同組織，其線粒體含量不同；通常1克植物組織的線粒體含量為10至50微克線粒體蛋白

16． 如果需要計量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解

17． 本產(chǎn)品可以獲得99％純度的線粒體

• 線粒體正�；钚詼y定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細(xì)胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內(nèi)外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列植物分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶