動物血小板高質純化線粒體分離試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI動物血小板高質純化線粒體分離試劑是一種旨在通過低速差速離心和化學滲壓休克處理來純化血小板、以及物理或化學破膜和等密度離心的方法，直接從動物血細胞中分離出活性完整而高度純化的血小板線粒體細胞器的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于人體和各種動物全血（鼠、豬、羊等）中血小板活性線粒體的制備。其制備物產量高，活性保證，純度可達99％。可以被用于線粒體酶活性、細胞凋亡、衰老、信號傳遞、能量代謝、蛋白組學和古生物學、病理生理學（神經病變或腫瘤）等的研究。產品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩定，分離產量和純度保證。

技術背景

線粒體細胞器的分離是現代細胞生物學研究的最常用的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術方法基本上采用：第一，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。 

產品內容

YIJI清理液（Reagent A）   250毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    40毫升

YIJI凈化液（Reagent C）    10毫升

YIJI強化液（Reagent D）     5毫升

YIJI保存液（Reagent E）   100毫升

YIJI活性液（Reagent F）   200微升

YIJI高純液（Reagent G）    55毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI高純液（Reagent G），避免光照；YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）嚴格無菌操作；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

4℃臺式離心機：用于樣品操作

4℃超速離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

超聲儀：用于裂解細胞

實驗步驟

• 物理處理法

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI活性液（Reagent F）凍融，然后移出20微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為YIJI裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備1個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時內抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細胞顆粒群松動
• 加入10毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽掉上清液
• 加入10毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放入臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 加入5毫升預冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約10下）（注意：參見注意事項11）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）置于超聲儀槍頭下，離心管在冰槽里
• （選擇步驟）超聲功率為60％（或150赫茲）猝擊10秒，間隙30秒，10個循環
• 放進4℃臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻沉淀顆粒
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復實驗步驟35至38一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

• 化學處理法

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI活性液（Reagent F）凍融，然后移出20微升YIJI活性液（Reagent F）和 1毫升YIJI凈化液（Reagent C）到4毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為YIJI裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備1個無菌的50毫升錐形離心管
• 輕輕混勻10至20毫升新鮮（2小時內抽取的靜脈血）的抗凝全血樣品
• 移入到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群
• 用手指輕彈離心管2至3下，使細胞顆粒群松動
• 加入10毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液合并到上述50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心15分鐘，速度為200g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管，留下200微升液體，以防抽取松動的細胞顆粒群（扔掉含有細胞顆粒群的離心管）――此步驟獲得血小板富集血清
• 放入含有上清液的離心管到臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽掉上清液
• 加入10毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放入臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心抽去上清液（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）――此步驟獲得純化的血小板
• 入5毫升預冷的YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預冷的YIJI強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項11）
• 加入5毫升預冷的YIJI保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），充分混勻沉淀顆粒
• 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作
• 移取5.5毫升的YIJI高純液（Reagent G）到6毫升超速離心管（注意：使用前搖勻YIJI高純液(Reagent G)）
• 輕輕加入500微升線粒體混勻液在YIJI高純液（Reagent G）的上面，避免震動
• 放進4℃超速離心機離心45分鐘，速度為40000g
• 小心取出超速離心管：可見下端棕色或乳黃色樣品帶（注意：在其上端可能有溶酶體樣品帶） 
• 小心抽去線粒體樣品帶以上的液體
• 小心收集線粒體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純線粒體樣品
• 加入1至2毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）重復實驗步驟36至38一次
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混勻
• 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存

注意事項

• 本產品為10次（10至20毫升全血/次）操作
• 其它實際操作的全血容量與試劑使用量按比例調整：例如40毫升全血，試劑用量加倍
• 操作時，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent E）
• 操作時，須戴手套
• 建議使用新鮮全血：2小時內的全血為理想狀態，不要超過24小時
• 全血樣品采集須使用EDTA二鉀血液抗凝液（GMS12059.1）、ACD血液抗凝液（GMS12059.4），或肝素鈉血液抗凝液（GMS12059.5）
• 建議使用足夠的樣品量
• 血小板提取量因人而異；如果不足，建議增加全血量
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態下進行
• 建議嚴格控制操作時間
• 物理處理法是優先推薦的技術處理

12． 本產品所獲得的線粒體純度（可達到99％）和產量最為理想

13． 使用YIJI高純液（Reagent G）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液

• 根據超速離心管的大小調整YIJI高純液（Reagent G）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 每毫升全血平均可獲得2 X 10⁸血小板
• 通常10毫升全血的血小板線粒體含量為10至25微克線粒體蛋白

17． 如果需要計量線粒體，稀釋后數分鐘內完成，否則線粒體將分解

• 線粒體正常活性測定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等
• 線粒體內外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和熒光JC染色
• 本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
• 本公司提供系列線粒體試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定分離的線粒體內外膜完整
• 本產品經鑒定分離的線粒體維持正常活性
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶