HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE細胞膜變檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

HOECHST 33342和PROPIDIUM IODIDE細胞膜變檢測試劑是一種旨在通過熒光染料的細胞膜差異通透性（differential permeability）呈現的DNA結合性熒光，來分析細胞膜損傷與否，進而定性或定量區別活細胞、死細胞（壞死細胞）和凋亡細胞狀況的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞類型（動物、人體、植物、昆蟲等）的觀察。產品嚴格無菌，即到即用，熒光清晰，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

赫斯特染料（Hoechst 33342）為特異性 DNA 活性染料，與 A-T 鍵結合，其激發波長是350nm，散發波長是460nm，呈現藍色熒光；而碘化丙啶（Propidium iodide；PI）為DNA堿基嵌入劑，沒有堿基結合優先性，其激發波長是488nm，散發波長是630nm，呈現紅色熒光。根據熒光染料的膜通透性特征：第一，定性確定細胞膜的損傷狀況；第二，定性或定量區別正常活細胞、死細胞（壞死細胞）、凋亡細胞等。正常活細胞，其胞膜完整，拒絕兩種染料進入胞內；死細胞，其胞膜完全破損，可以呈現兩種熒光；凋亡細胞，選擇性拒絕碘化丙啶進入，允許赫斯特染料進入，且熒光強度高于正常活細胞。

產品內容

YIJI清理液（Reagent A） 150毫升

YIJI補充液（Reagent B）  35毫升

YIJI染色液A（Reagent C） 200微升

YIJI染色液B（Reagent D） 200微升

產品說明書   1份

保存方式

保存YIJI染色液A（Reagent C）和YIJI染色液B（Reagent D）在－20℃冰箱里，用鋁箔封裹，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養液（GMS12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于細胞收集的容器

1.5毫升離心管：用于細胞染色的容器

（微型）臺式離心機：用于細胞收集的操作

熒光顯微鏡：用于觀察細胞熒光染色

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，從－20℃冰箱里取出YIJI染色液A（Reagent C）和YIJI染色液B（Reagent D），置入冰槽里融化，避免光照。移出350微升YIJI補充液（Reagent B）和4微升YIJI染色液A（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，混勻后標記為YIJI染色工作液A。再次移出350微升YIJI補充液（Reagent B）和4微升YIJI染色液B（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，混勻后標記為YIJI染色工作液B。然后進行下列操作：

• 直接法

• 準備1個細胞培養12孔板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約30萬細胞數）
• 小心抽去細胞培養液
• 輕輕沿著孔壁加入1毫升 YIJI清理液（Reagent A）到細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 小心抽去1毫升 YIJI清理液（Reagent A）
• 小心加入354微升含有YIJI補充液（Reagent B）和YIJI染色液A（Reagent C）的YIJI染色工作液A， 覆蓋培養孔表面
• 放進37℃培養箱孵育10分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 即刻置于冰槽里
• 小心加入354微升含有YIJI補充液（Reagent B）和YIJI染色液B（Reagent D）的YIJI染色工作液B， 覆蓋培養孔表面
• 在冰槽里孵育10分鐘
• 輕輕沿著孔壁加入1毫升 YIJI清理液（Reagent A）到細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 小心抽去1毫升 YIJI清理液（Reagent A）
• 即刻在倒置熒光顯微鏡下進行觀察：同一視野，先使用光學顯微鏡觀察細胞位置，然后使用紫外熒光觀察藍色細胞，最后使用紅色熒光，觀察紅色細胞。按照下表進行分析：

• 間接法

• 準備1個細胞培養12孔板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約30萬細胞數）
• 小心移出細胞培養液到15毫升錐形離心管（收集懸浮細胞）
• 加入1毫升 YIJI清理液（Reagent A）到細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 小心移出1毫升 YIJI清理液（Reagent A）到15毫升錐形離心管（收集洗脫細胞）
• 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養孔表面
• 放進37℃培養箱孵育1分種
• 輕輕手擊震動培養板，使細胞脫落
• 加入1毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 移入到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升YIJI清理液（Reagent A）
• 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入354微升含有YIJI補充液（Reagent B）和YIJI染色液A（Reagent C）的YIJI染色工作液A，混勻
• 放進37℃培養箱孵育10分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入354微升含有YIJI補充液（Reagent B）和YIJI染色液B（Reagent D）的YIJI染色工作液B，混勻
• 在冰槽里孵育10分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升YIJI清理液（Reagent A），混勻
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（或7000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升YIJI清理液（Reagent A），混勻
• 即刻移取50微升在載玻片上壓片
• 在熒光顯微鏡下進行觀察：同一視野，先使用光學顯微鏡觀察細胞位置，然后使用紫外熒光觀察藍色細胞，最后使用紅色熒光，觀察紅色細胞。按照下表進行分析：

• 或轉入到細胞流式儀專用測試管，即刻進行細胞流式儀分析：觀察50000個細胞以上
• 建立地形圖或散點圖以及直方圖分析

注意事項

• 本產品為50次（8個12孔細胞培養板）操作
• 所有操作均須無菌狀態下進行
• 確保實驗準確性，須收集所有懸浮和貼壁細胞；同時要確保足夠的細胞數
• 可用35mm培養皿、6孔培養板或25cm²細胞培養瓶操作，相應增加染色液的用量。但12孔培養板為理想選擇
• 操作時，須戴手套
• 孵育時，須避免光照
• 建議細胞染色完成后，即刻進行分析
• 細胞流式儀分析前，須混勻內容物
• 細胞流式儀分析，細胞檢測量不得少于10000個
• 細胞類型不同，對于染色的反應會不同
• 告知流式儀技術員有關細胞類型
• 本公司提供系列細胞凋亡試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰