植物細胞周期S期同步（SYNCHRONY）處理試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

植物細胞周期S期同步（SYNCHRONY）處理試劑是一種旨在使用蔗糖缺陷和羥基脲雙重處理，誘導活體細胞樣品同步處于細胞周期S期狀態的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種代表性植物懸浮細胞（例如擬南芥MM1、MM2d、煙草細胞BY-2等）以及轉化后細胞的細胞周期S期同步化處理。產品嚴格無菌，即到即用，性能穩定，作用顯著。

技術背景

細胞周期同步化（cell cycle synchrony）是通過外在的化學處理，使所有或絕大部分細胞處于同一細胞生長周期的特定階段（G0、G1、S、G2、M等），同步實施相同的生化代謝活動，便于創造參數可控、目標明確的研究條件，來發現內源性或外源性因子產生的細胞變化的關聯性，確定細胞周期特異性基因表達和分子分布，以及細胞結構狀況，例如成膜體（phragmoplast）等。快速生長的植物細胞的細胞周期分為4個周期：G1（growth 1；生長期1；4至8小時）、S（synthesis；DNA復制；5小時）、G2（growth 2；生長期2；2至4小時）、M（mitosis；細胞有絲分裂；2至3小時）期。細胞周期依賴性激酶（cyclin dependent kinase；CDK）復合體調節細胞進入不同周期。通過使用不同的抑制劑達到特定周期的阻滯與釋放（arrest and release），直至所有細胞同步。S期同步處理方法是通過蔗糖缺陷和羥基脲（hydroxyurea）雙重處理后，抑制核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase）活性，從而阻止核糖核苷酸（dNTPs）合成，達到抑制DNA合成，致細胞周期阻滯，使細胞誘導處于S期。

產品內容

清理液（Reagent A）     2 X 500毫升

處理液（Reagent B）          2 毫升

產品說明書           1份

保存方式

保存處理液（Reagent B）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

 Murashige & Skoog基礎培養基（12323）：用于植物細胞培養的營養基

50毫升錐形離心管：用于培養細胞的容器

恒溫搖床：用于細胞孵育

20微米尼龍網：用于清洗

小型漏斗：用于清洗的裝置

4℃臺式離心機：用于樣品操作

實驗步驟

• 準備1管20毫升的植物懸浮細胞
• 轉移到50毫升錐形離心管
• 使用MS（Murashige and Skoog medium）完全培養基（MS+蔗糖、二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyaceticacid；2,4-D）、呋喃甲基腺嘌呤（kinetin）
• 放進27℃搖床孵育7天，速度為130RPM（注意：根據細胞特點，采取光照或暗室）
• 準備1個小型漏斗，內襯20微米尼龍網，置于50毫升錐形離心管上
• 將所有細胞內容液移入到小型漏斗里過濾
• 加入20毫升清理液（Reagent A），清洗過濾5分鐘
• 重復加入20毫升清理液（Reagent A），清洗過濾5分鐘
• 轉移細胞到新的50毫升錐形離心管
• 加入20毫升清理液（Reagent A），混勻
• （替代過濾步驟5至10）放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• （替代過濾步驟5至10）小心抽去上清液
• （替代過濾步驟5至10）加入20毫升清理液（Reagent A），混勻
• （替代過濾步驟5至10）放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• （替代過濾步驟5至10）小心抽去上清液
• （替代過濾步驟5至10）重復實驗步驟13至15一次
• （替代過濾步驟5至10）加入20毫升清理液（Reagent A），混勻
• 移取4毫升懸浮細胞到新的50毫升錐形離心管
• 加入16毫升新鮮的清理液（Reagent A）
• 放進27℃搖床孵育24小時，速度為130RPM（注意：根據細胞特點，采取光照或暗室）
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• 小心抽去上清液
• 加入20毫升用戶自備的MS完全培養液
• 放進27℃搖床孵育1小時，速度為130RPM（注意：根據細胞特點，采取光照或暗室）
• 移取4毫升懸浮細胞到新的50毫升錐形離心管
• 加入16毫升新鮮的MS（Murashige and Skoog medium）完全培養基
• 加入200微升處理液（Reagent B）
• 放進27℃搖床孵育18小時，速度為130RPM（注意：根據細胞特點，采取光照或暗室）
• 準備1個小型漏斗，內襯20微米尼龍網，置于50毫升錐形離心管上
• 將所有細胞內容液移入到小型漏斗里過濾
• 加入20毫升用戶自備的MS基礎培養基，清洗過濾5分鐘
• 重復實驗步驟31四次
• 轉移細胞到新的50毫升錐形離心管
• （替代過濾步驟29至33）放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• （替代過濾步驟29至33）小心抽去上清液
• （替代過濾步驟29至33）加入20毫升用戶自備的MS基礎培養基，混勻
• （替代過濾步驟29至33）放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（注意：如果細胞難以沉淀，可以增加到3000g）
• （替代過濾步驟29至33）小心抽去上清液
• （替代過濾步驟29至33）重復實驗步驟36至38四次
• 加入20毫升用戶自備的MS完全培養液
• 放進27℃搖床孵育2小時，速度為130RPM――細胞進入S期
• 繼續后續操作，包括細胞流式儀鑒定（注意：建議使用植物細胞流式細胞儀細胞周期紅色熒光分析試劑盒――10405）

注意事項

• 本產品為10次操作
• 本產品適用于快速生長（倍增時間24小時內），且分散充分的植物懸浮細胞
• 擬南芥PSB-D、T87，以及其它植物懸浮細胞均可使用
• 本產品可以達到80%細胞以上同步出現S期
• 操作時，須戴手套
• 操作時，須嚴格無菌操作
• 用戶可以根據需求，使用不同的細胞用量，相應調整試劑用量
• 用戶可以根據不同細胞類型，采取光照或暗室培養
• 建議使用過濾清洗為優選
• 通常情況下，同步化處理后的細胞周期和時間關系參考如下

• 本公司提供系列細胞周期分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無細菌、病毒和支原體污染