銅離子膜通道轉運功能（P型ATP酶）綠色熒光檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

銅離子膜通道轉運功能（P型ATP酶）綠色熒光檢測試劑是一種旨在使用銅離子熒光探針，自由進入囊泡內或細胞內，一旦銅離子進入產生熒光淬滅，來分析和觀察銅離子轉運功能，進一步評價P型ATP酶中的銅ATP酶功能的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物、人體、真菌/酵母、植物細胞或細胞器（高爾基體、線粒體、溶酶體、囊泡、胞漿等）銅離子轉運活性，即P型ATP酶的銅ATP酶功能的檢測，以及抑制劑篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

細胞膜上的膜整合蛋白（integral membrane protein）參與細胞內外的物質傳輸、能量產生與轉化等生物學過程，構成離子或代謝分子的通道，常見的包括氫離子、鈉離子、鉀離子、重金屬離子等，在能量依賴型或非依賴型的條件下，完成生理代謝的物質交換。膜通道轉運功能檢測（transport或uptake assay）用于分析轉運蛋白（transport protein）和底物（substrate）的功能、篩選通道抑制劑、進而發現藥物以及抗藥性機制。建立分子構建的載體或宿主模型、分離膜性囊泡（membrane vesicle）包括正常外向膜性囊泡（Right-side out；RSOV）或內側外翻膜性囊泡（In-side out；IOV），通過標記底物的轉運，來定量測定轉運活性。銅離子膜通道轉運功能，即銅轉運P型ATP酶（copper transporting P-type ATPase）或重金屬轉運P型ATP酶（heavy metal transporting P-type ATPase），分成兩種：ATP7A（Menkes病蛋白；Menkes disease protein）和ATP7B（Wilson病蛋白；Wilson disease protein），前者異常導致系統性銅缺陷，而出現神經退行性病變；后者異常導致導致肝臟和腦組織銅堆積，而產生肝硬化和腦變性病變。銅離子作為機體第三大瞬時性必需微量金屬（transition metal）和多種酶（細胞色素C氧化酶和過氧化物歧化酶等）的輔因子，通過銅ATP酶，控制銅離子的吸收、聚集、運送、去毒等作用，維持微環境銅離子平衡（濃度為10^-18至-13摩爾），實現銅離子的生理功能，包括線粒體電子傳導、病原菌防御、植物細胞壁木質化（lignification）、維生素C代謝、固氮、碳水化合物代謝、脂肪酸羥基化和去飽和化等。通過使用銅離子熒光探針Phen Green，一種金屬結合性菲咯啉（phenanthroline）二價連接在熒光素上的熒光化合物，自由性進入各種細胞或囊泡（vesicle）內，在ATP的存在下，銅離子轉運穿過質膜，與熒光探針結合，使綠色熒光淬滅（激發波長506nm，散發波長530nm），以分析轉運蛋白P型ATP酶中銅ATP酶的功能，以及其抑制劑的篩選。  

產品內容

緩沖液（Reagent A）  80毫升

標記液（Reagent B）   1毫升

離子液（Reagent C）   1毫升

補充液（Reagent D）   1毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽或培養箱：用于反應孵育

1毫升比色皿：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀：用于熒光定量分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 確定測定對象：動物/人體、真菌/酵母或植物
• 分離膜性囊泡（注意：建議使用系列分離試劑盒產品）：

• 準備好待測的分離樣品，置于冰槽里備用

• 測定準備

• 開啟并設定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發波長為506nm，散發波長530nm，間隔15秒測讀1次，持續5分鐘，并置零
• 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置于室溫下凍融預熱，避免光照。然后進行下列操作

• 熒光測定

• 準備2個1.5毫升離心管，并標記為對照樣品管、抑制劑樣品管
• 分別加入800微升緩沖液（Reagent A） 
• 加入50微升補充液（Reagent D）到對照樣品管
• 加入50微升用戶自備的抑制劑（注意：使用各種濃度梯度）到抑制劑樣品管（注意：如果檢測樣品銅離子轉運，可以省略這一操作）
• 分別加入100微升待測樣品（500微克蛋白或5 X 10⁴細胞）
• 分別加入50微升標記液（Reagent B）
• 放進37℃恒溫培養箱孵育10分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 分別小心抽去上清液，避免液體殘留
• 分別加入1毫升緩沖液（Reagent A），混勻顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 分別小心抽去上清液，避免液體殘留
• 重復實驗步驟11至13一次
• 分別加入1毫升緩沖液（Reagent A），混勻顆粒群
• 轉移到比色皿或酶標板
• 分別加入20微升離子液（Reagent C）
• 小心槍頭混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進熒光分光光度儀（激發波長為506nm，散發波長530nm）：獲得0分鐘和設定系列時間至5分鐘的相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）――

RFU降低，表明銅離子轉運功能活性增強

• 構建轉運曲線：縱座標（Y）為相對熒光單位（RFU），橫座標（X）為時間（秒或分鐘）
• 構建抑制曲線（設定終點5分鐘）：縱座標（Y）為相對熒光單位（RFU），橫座標（X）為抑制劑濃度（微摩爾）
• 構建百分率抑制曲線（設定5分鐘）：縱座標（Y）為抑制百分率（％），橫座標（X）為抑制劑濃度（微摩爾）
• 根據上述曲線，計算IC50（50％抑制率所需的抑制劑濃度）

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議用戶使用本公司的膜性囊泡（RSOV）制備試劑盒準備樣品
• 孵育時，避免光照
• 建議加入離子液（Reagent C）后，即刻進行熒光檢測分析
• 用戶根據實驗情況，可以調整終點時間：2分鐘、3分鐘、5分鐘
• 用戶可以在某個時間點，加入抑制劑，觀察轉運走勢變化
• 銅離子轉運單位可以使用ΔRFU/分鐘/毫克蛋白等
• 可以使用銅螯合劑三乙烯四胺二鹽酸鹽（triethylenetetramine dihydrochloride；20微摩爾）作為抑制劑對照
• 本公司提供系列離子膜通道轉運功能（transport/uptake）分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰