藻類細胞甲磺酸乙脂突變誘導試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

藻類細胞甲磺酸乙脂突變誘導試劑是一種旨在使用烷化劑甲磺酸乙酯飽和性誘導藻類細胞發生變異而產生基因功能缺失或獲得的突變株，成為細胞遺傳標記和生理代謝特征篩選的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種藻類細胞包括藍藻、微藻等的誘導突變。產品嚴格無菌，即到即用，性能穩定，突變頻率高。

技術背景

誘導突變（mutagenesis），包括物理（放射性）、化學、插入方法等，作為一種有效手段，用來確定和分析生物體的基因功能，即通過基因突變所產生的表型變異和生理反應。甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate；methanesulfonic acid ethyl ether；ethylmesylate；EMS）是一種化學誘變致畸的烷化劑（alkylating agent）。通過導致錯配和堿基變異，即C/G替換成T/A，產生同一基因上或基因組上隨機多樣性突變位點，以此發現基因的功能缺失或功能獲得，以及特定氨基酸在蛋白質中的功能所在（正向篩選）。同時進一步分析其單核苷酸多態性與基因功能的關系（逆向篩選），從而了解藻類生長和代謝的生物學機制。

產品內容

對照液（Reagent A）       2毫升

誘導液（Reagent B）   2毫升

中和液（Reagent C） 100毫升

產品說明書       1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

藻類細胞特定培養液：用于培養藻類細胞

50毫升錐形管：用于藻類細胞突變誘導的容器

搖床：用于細胞孵育

臺式離心機：用于收集細胞

超聲儀：用于分離細胞

瓊脂平板培養基：用于觀察藻類細胞群落

 實驗步驟

（一）誘導

• 準備2個無菌的50毫升錐形離心管：1管為對照管，另1管為誘導管
• 分別加入50毫升用戶自備的藻類細胞特定培養液
• 分別接種用戶待測的藻類細胞（藍藻、金藻等）
• 放進搖床（速度為200RPM），25℃溫度條件，在直接光照（強度5000 lx）下，孵育細胞，直至細胞生長到指數生長期，達2 X 10⁷細胞/毫升
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 分別小心抽去上清液
• 分別加入50毫升用戶自備的新鮮培養液，混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 分別小心抽去上清液
• 分別加入12.5毫升用戶自備的新鮮培養液，混勻細胞顆粒群
• 每次移取2.5毫升細胞懸液到超聲處理管里，進行100瓦超聲處理，功率20％，時間15秒
• 超聲完成，轉移到2個新的對應編號的50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 分別小心抽去上清液
• 分別加入50毫升用戶自備的新鮮培養液，混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 分別小心抽去上清液
• 分別加入20毫升用戶自備的新鮮培養液，混勻細胞顆粒群
• 加入200微升對照液（reagent A）到1號管，混勻
• 加入200微升誘導液（reagent B）到2號管，混勻
• 同時放進搖床（速度為200RPM），25℃溫度條件，在直接光照（強度5000 lx）下，孵育90分鐘
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 分別小心抽去上清液

（二）篩選

• 加入10毫升中和液（Reagent C）到2號管，混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 小心抽去上清液
• 分別加入20毫升用戶自備的新鮮培養液到1號和2號管，混勻細胞顆粒群
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 分別小心抽去上清液
• 分別加入20毫升用戶自備的新鮮培養液，混勻細胞顆粒群
• 同時放進搖床（速度為200RPM），48℃溫度條件，在直接光照（強度5000 lx）下，孵育30分鐘
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 分別小心抽去上清液
• 分別加入3毫升用戶自備的新鮮培養液，混勻細胞顆粒群
• 同時放進搖床（速度為200RPM），25℃溫度條件，在直接光照（強度5000 lx）下，孵育10小時
• 放進臺式離心機離心30分鐘，速度為3500g
• 分別小心抽去上清液
• 分別加入1毫升用戶自備的新鮮培養液，混勻細胞顆粒群
• 篩選處理如下：
  • 分別移取300微升細胞懸液在用戶自備的氯霉素（30倍濃度）或5－氟胞嘧啶（40倍濃度）瓊脂平板培養基上鋪板培養：25℃溫度條件，在直接光照（強度5000 lx）下，孵育48小時，或直至群落出現――表明誘導成功（比較對照組）
  • 分別移取300微升細胞懸液在用戶自備的特殊瓊脂平板培養基上鋪板培養：25℃溫度條件，在直接光照（強度5000 lx）下，孵育48小時，或直至群落出現――觀察特異表型變異（比較對照組）
  • 分別移取300微升細胞懸液在用戶自備的一般瓊脂平板培養基上鋪板培養：25℃溫度條件，在直接光照（強度5000 lx）下，孵育48小時，或直至群落出現――觀察色澤白化變化（比較對照組）
  • 分別移取50微升細胞懸液在載玻片上（或進行染色），置于顯微鏡下——觀察鞭毛變化（比較對照組）

注意事項

• 本產品為10次操作規格
• 操作時，須戴手套；嚴格注意操作安全
• 操作時，須無菌操作
• 甲磺酸乙酯為有毒揮發性致畸劑，因此所有接觸過的器皿和用品都要使用0.1 M硫代硫酸鈉（Sodium Thiosulfate ；Na₂S₂O₃）沖洗或中和。溶液里須加入終濃度為0.1M硫代硫酸鈉，在室溫下孵育至少10分鐘，然后廢棄處理掉；建議使用-1.0 M 硫代硫酸鈉溶液－12043
• 用戶根據待測藻類細胞的特點，使用相應的培養基和培養條件，包括光照強度、培養溫度等
• 用戶根據需求，篩選出特殊生理、生化、或代謝型突變株
• 本公司提供系列甲磺酸乙脂誘導突變試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定誘導突變頻率高