細菌趨化作用（chemotaxis）軟瓊脂檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細菌趨化作用（chemotaxis）軟瓊脂檢測試劑是一種旨在采用半固體瓊脂糖，構建化學趨化物（chemoattractant）彌散形成濃度差異的空間，觀察細菌群移現象、環形（ring）標志，以及空白區域等外觀形態，進行分析細菌趨化作用的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其特別適用于各種細菌以及突變型、轉基因處理細菌的趨化性研究和篩選，同時檢測趨化因子和抑制因子的作用。產品嚴格無菌，即到即用，性能穩定，操作簡便，重復一致。

 

技術背景

 

趨化性（chemotaxis）是指細胞或生物體對于介質中的特定化學分子的濃度差異形成的刺激所引起的趨向運動。許多種類的游動細胞具有趨化性，例如細菌和阿米巴細胞朝著食物源移動；人體免疫細胞包括巨噬細胞和中性白細胞朝著外來入侵細胞移動。此外，許多在發育進程中發生的形態變化與細胞向化學物質濃度差異趨化移動相關。細菌趨化性是細胞感受化學信號，由膜結合受體連接到細胞內傳遞機制，通過鞭毛運動產生相應的移動反應。細菌趨化性檢測包括時相（temporal）和空間（spatial）梯度檢測。其中軟瓊脂群移平板檢測（soft-agar swarming plate assay）是空間梯度分析的常用方法。作為半固體介質之一的瓊脂糖（Agarose），構建化學趨化物（chemoattractant）彌散形成濃度差異的空間，觀察細菌群移現象、環形（ring）標志，以及空白區域等外觀形態，進一步分析野生型和突變型細菌，以及化學引誘分子（chemoattractant）和化學排斥分子（chemorepellent）的趨向變化。

 

產品內容

 

通用介質液（Reagent A） 100毫升

選擇介質液（Reagent B） 100毫升

重懸液（Reagent C）  10毫升

產品說明書   1份

 

保存方式

 

保存在4℃的冰箱里；有效保證6月 

 

用戶自備

 

50毫升錐形離心管：用于混勻介質液的容器

100mm培養皿：用于細菌趨化實驗的容器

恒溫水�。河糜谠噭┍�溫

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于細菌培養

量尺：用于測量細菌移動距離

 

實驗步驟

 

一、 瓊脂平板準備

 

1． 將通用介質液（Reagent A）或選擇介質液（Reagent B）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）

2． 放進50℃恒溫水浴

3． 移出20毫升通用介質液（Reagent A）或選擇介質液（Reagent B）到50毫升錐形離心管

4． 即刻加入1毫升用戶自備的待測的化學趨化分子

5． 上下傾倒混勻

6． 最快速度倒入100mm培養皿

7． 均勻鋪滿整個底面，避免氣泡產生

8． 置于室溫下至少2小時或4℃冰箱里1小時，使膠體凝固

9． 倒置培養皿，在其外底面，用尺和標記筆做好標記――根據檢測要求設置如下：

1）一板多點

2）一板單點

  

 

二、 細菌準備

 

1． 準備10毫升過夜生長的新鮮的培養細菌（OD590=0.4，達5 X 10⁷細菌/毫升）

2． 移取1毫升到新的1.5毫升離心管

3． 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g

4． 小心抽掉上清液

5． 加入1毫升重懸液（Reagent C），混勻

6． 置于冰槽里備用

 

三、 趨化實驗

 

1． 加入10微升上述準備的待測細菌到相應的標記點位

2． 室溫下靜置30分鐘

3． 小心放進35℃培養箱孵育6至8小時（一板多點）或24至48小時（一板單點），保持培養箱濕潤

4． 觀察細菌群移現象：建議每隔2小時觀察1次

5． 直至出現趨化環

6． 結果分析：

1) 使用量尺進行細菌移動距離測量：細菌點和細菌趨化環之間的距離

2) 細菌趨化環密度計量：包括所有移動細胞，或設定移動區域的細胞

7． 構建距離、密度、時間、趨化物濃度包括空白對照的關系曲線

8． 確定趨化系數（chemokinesis coefficiency）：趨化物濃度和細菌移動密度的關系曲線的斜率

 

注意事項

 

• 本產品為10次（100mm培養皿）操作
• 其它實際操作的培養皿大小與試劑使用量按比例調整
• 所有培養操作和使用工具均須在嚴格無菌狀態下進行
• 操作時須戴手套
• 建議使用系列趨化物濃度進行檢測比較；注意一板只能進行一種濃度檢測
• 通常不同細菌分析比較，可以采用一板多點
• 通用介質液（Reagent A）常用于不同細菌（例如突變菌等）的比較分析或明確趨化分子的檢測；更適合于排斥分子的分析
• 選擇介質液（Reagent B）常用于單一趨化分子或未知趨化分子的分析
• 建議待測細菌量為10⁵細菌/樣品點 
• 建議細菌為新鮮培養
• 已經鋪板但暫時保存的含凝膠體的培養板或培養皿，用PARAFILM密封，在4℃冰箱里儲存
• 操作時小心輕柔，避免膠體脫位
• 通常細菌移動為4至24小時之間；注意隨時觀察，避免細菌移動過快，失去分析良機
• 排斥分子檢測可以持續觀察至48小時終止
• 通用介質液（Reagent A）的正常細菌的趨化性參考圖像

 

 

 

 

 

• 選擇介質液（Reagent B）的正常細菌的單一趨化分子的趨化性參考圖

 

• 本公司提供系列細胞趨化分析試劑產品

 

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無病毒和支原體污染
• 本產品經鑒定重復率好