 |
|
|||||||||||||||||||||||||||||
| [發(fā)表評(píng)論] [本類(lèi)其他產(chǎn)品] [本類(lèi)其他供應(yīng)商] [收藏] | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 銷(xiāo)售商： 上海一基實(shí)業(yè)有限公司 | 查看該公司所有產(chǎn)品 >> |
植物組織ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
植物組織ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)系統(tǒng)，熒光素在酶的催化下，與ATP發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生生物光能，采用冷光儀測(cè)定其相對(duì)冷光單位的變化，來(lái)定量分析植物組織樣品中ATP濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等的ATP檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。
技術(shù)背景
三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞活力的標(biāo)志。一旦細(xì)胞凋亡或壞死，ATP濃度急遽下降。螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase）是62 kd 的單體蛋白，催化ATP依賴(lài)性熒光素（luciferin）的氧化，經(jīng)過(guò)電子轉(zhuǎn)移，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為氧化型熒光素（oxyluciferin）的光能，與ATP量成線(xiàn)性正相關(guān)，通過(guò)冷光儀（560nm）檢測(cè)，由此定量ATP濃度。其反應(yīng)方式為：
luciferase
ATP + D-Luciferin ＋ O2 → Oxyluciferin + AMP ＋ PPi ＋ CO2 ＋ Light
Mg2+
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 150毫升
裂解液（Reagent B） 50毫升
緩沖液（Reagent C） 2.5毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 250微升
標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） 20微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證3月
用戶(hù)自備
1.5毫升離心管：用于樣品保存和標(biāo)準(zhǔn)液配制的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
50毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
黑色96孔板：用于冷光檢測(cè)操作的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀
冷光儀：用于樣品冷光檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)步驟
- 待測(cè)樣品準(zhǔn)備
- 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定500毫克組織重量
- （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 移入到一個(gè)液氮凍存管
- 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
- 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
- 加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B）
- 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/em>）
- 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
- 小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管
- 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
- 標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)備
- 設(shè)置好冷光儀：溫度25℃，1秒延時(shí)（Delay），1秒整合（Integration）檢測(cè)。同時(shí)關(guān)上操作室的燈光
- 準(zhǔn)備好8個(gè)無(wú)菌的1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至8號(hào)管
- 按下表分別加入適量的裂解液（Reagent B）到每個(gè)離心管
- 移取5微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻
- 小心移取50微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻
- 小心移取50微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻
- 小心移取50微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻
- 以此類(lèi)推
- 將1至8號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表
|
管號(hào) |
裂解液（Reagent B） |
標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） |
標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度 |
|
1 |
495微升 |
5微升 |
10－4摩爾/升 |
|
2 |
450微升 |
50微升1號(hào)管 |
10－5摩爾/升 |
|
3 |
450微升 |
50微升2號(hào)管 |
10－6摩爾/升 |
|
4 |
450微升 |
50微升3號(hào)管 |
10－7摩爾/升 |
|
5 |
450微升 |
50微升4號(hào)管 |
10－8摩爾/升 |
|
6 |
450微升 |
50微升5號(hào)管 |
10－9摩爾/升 |
|
7 |
450微升 |
50微升6號(hào)管 |
10－10摩爾/升 |
|
8 |
200微升 |
空白對(duì)照 |
0 |
- 活性測(cè)定
測(cè)定開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的緩沖液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升離心管，加入50微升反應(yīng)液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，放在暗室冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。
- 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板，并做好標(biāo)記：包括背景空對(duì)照孔，標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照孔，以及待測(cè)樣品孔
- 分別加入50微升裂解液（Reagent B）、稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）和待測(cè)樣品到相應(yīng)孔里
- 分別加入50微升反應(yīng)工作液到所有孔里
- 室溫下（22℃）孵育1分鐘，避免光照
- 即刻放進(jìn)冷光儀檢測(cè)：1秒延時(shí)，1秒檢測(cè)
- 獲得相對(duì)發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）：標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照孔或待測(cè)樣品孔R(shí)LU－背景空對(duì)照孔R(shí)LU
- 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)發(fā)光單位（RLU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度（摩爾/升）
- 計(jì)算樣品ATP濃度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)算
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為50次操作
- 本產(chǎn)品檢測(cè)敏感度達(dá)10-12摩爾/升
- 用戶(hù)根據(jù)實(shí)際情況，選擇5管標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間范圍
- 所有操作均須無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行
- 操作時(shí)，須戴手套
- 建議每個(gè)樣品安排3個(gè)孔，即重復(fù)3次，計(jì)算時(shí)取其平均值
- 反應(yīng)液（Reagent D）具有光高度敏感性，因此整個(gè)操作須避光進(jìn)行，避免反復(fù)凍融
- 由于ATP無(wú)處不在，且熱穩(wěn)定性。建議使用的槍頭、用具須嚴(yán)格無(wú)菌，避免重復(fù)使用；操作時(shí)避免污染試劑溶液，不得用手觸摸試劑容器的內(nèi)蓋
- 如果用戶(hù)沒(méi)有冷光儀，可以使用閃爍探測(cè)器（scitillation counter 或β計(jì)數(shù)器）替代，但敏感性較低
- 如果樣品ATP濃度較低，可以整合檢測(cè)至10秒
- 如果是注射式冷光儀，建議測(cè)試前后使用無(wú)離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道
- 本公司提供系列ATP檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
24小時(shí)電話(huà)： 13311756131
客服: QQ:2851717098
