通用型基因甲基化檢測試劑盒產品說明書(中文版)

主要用途

通用型基因甲基化檢測試劑是一種旨在通過化學方法使基因組中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）轉變成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，經過甲基化特異性PCR擴增或直接測序，探測到基因甲基化信息的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于父母印記、X染色體研究、腫瘤抑制基因等表觀遺傳學研究。產品即到即用，性能穩定，操作簡便，轉化保證。

技術背景

在基因的啟動子區域（promotor region）通常存在一些富含重復雙核苷酸“CG”的區域，稱為“CpG島”（CpG island）。在人類基因組內，存在有近3萬個CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標志，而且還參與基因表達的調控和影響染色質的結構，更是DNA甲基化的唯一位置。CpG島甲基化形態的掃描分析是基因表達和表觀基因組學的主要課題。

產品內容

緩沖液（Reagent A）  2 X 1.5 毫升變性液（Reagent B） 250微升處理液（Reagent C）   1毫升轉化液（Reagent D）  12毫升封隔液（Reagent E）   5毫升凈化液（Reagent F）  20毫升萃取液（Reagent G）   40毫升濃縮液（Reagent H）   2毫升助沉液（Reagent I）  20微升沉淀液（Reagent J）  10毫升清理液（Reagent K）    20毫升保存液（Reagent L）   1毫升擴增液（Reagent M） 900微升補充液（Reagent N）   1毫升針筒離心柱  20套

產品說明書   1份

保存方式

保存GENMED處理液（Reagent C）、GENMED轉化液（Reagent D）、GENMED助沉液（Reagent I）、GENMED擴增液（Reagent M）和GENMED補充液（Reagent N）在－20℃冰箱里；GENMED凈化液（Reagent F）和GENMED針筒離心柱保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；GENMED處理液（Reagent C）和GENMED轉化液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應物

微型臺式離心機：用于沉淀樣品或去除雜質

渦旋震蕩儀：用于混勻反應物

真空泵：用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞：用于去除樣品中的液體成分

PCR儀：用于樣品擴增

PCR管或平板：用于PCR反應的容器

測序試劑盒：用于測序前的產物處理

實驗步驟

實驗開始前，將GENMED處理液（Reagent C）和GENMED轉化液（Reagent D）從－20℃冰箱中取出，在室溫下融化。同時將其中一管GENMED緩沖液（Reagent A）放進65℃恒溫水槽中預熱備用。然后進行下列操作：

• 轉化實驗

• 準備1個2.0毫升離心管
• 加入2微克DNA樣品
• 加入適量的GENMED緩沖液（Reagent A）到50微升反應體系（注意：不要使用65℃預熱的GENMED緩沖液（Reagent A））
• 加入5.5微升GENMED變性液（Reagent B），混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入30微升GENMED處理液（Reagent C）（注意：可見溶液呈現黃色）
• 在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒，充分混勻
• 加入520微升GENMED轉化液（Reagent D），上下傾倒混勻
• 加入200微升GENMED封隔液（Reagent E）
• 放進55℃恒溫水槽孵育16小時
• 小心抽去200微升GENMED封隔液（Reagent E）
• 加入1毫升充分搖勻的GENMED凈化液（Reagent F），上下傾倒混勻（注意：GENMED凈化液（Reagent F）出現沉淀，37℃溫育后使用）
• 移入到針筒離心柱
• 連接到真空泵，將柱內液體抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內液體）
• 加入1毫升GENMED萃取液（Reagent G）
• 運用真空泵，將GENMED萃取液（Reagent G）抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內液體）
• 重復實驗步驟15至16一次
• 去掉針筒，將離心柱放在1.5毫升離心管上
• 放進微型臺式離心機離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）（注意：去掉殘余萃取液）
• 加入50微升65℃預熱的GENMED緩沖液（Reagent A）到離心柱
• 室溫下靜置1分鐘
• 將離心柱放在新的1.5毫升離心管上
• 放進微型臺式離心機離心20秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉離心柱
• 加入5.5微升GENMED變性液（Reagent B）到離心管，混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入82微升GENMED濃縮液（Reagent H）
• 加入1微升GENMED助沉液（Reagent I）
• 加入400微升GENMED沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩30秒
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升GENMED清理液（Reagent K）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升GENMED保存液（Reagent L）
• 放進－20℃冰箱長期保存

二、甲基化特異性PCR

• 將GENMED擴增液（Reagent M）和補充液（Reagent N）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對一個樣本，每次移出15微升GENMED擴增液（Reagent M）到PCR管
• 加入1微升上述轉化實驗中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入1微升用戶自備的甲基化特異性的引物F和引物R（各350納克或25微摩爾）
• 再加入7微升GENMED補充液（Reagent N）（反應總量為25微升）
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項12）
• 即刻進行熱啟動PCR反應：

• 反應完畢后，移取5微升進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳或15％聚丙烯酰胺凝膠
• 如果進行測序鑒定，膠回收PCR產物（建議使用GENMED高質純化一步法膠回收試劑盒；20007.2）
• 分別移出2微升反應液到2個不同的新的1.5毫升離心管（每微升100納克）
• 加入1微升用戶自備的甲基化特異性的巢式引物F（每微升350納克）到其中一個1.5毫升離心管，作好標記
• 加入1微升用戶自備的甲基化特異性的巢式引物R（每微升350納克）到另一個1.5毫升離心管，作好標記
• 進行后續的直接測序反應

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 轉化后的DNA樣本須保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融，否則容易降解；同時盡快進行擴增等后續操作
• 一個特定基因的甲基化檢測通常包括轉化、PCR和直接測序三步。PCR用于篩選和定位，可以發現0.1%甲基化；測序是精確定位，是分析金標準
• 一個特定基因的甲基化特異性PCR通常包括三組PCR：野生型（W）、轉化后甲基型（M）、轉化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設計原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個CpG位點；CpG位點須在3端；PCR片段長度在80－250堿基；三組引物取自同一位點，通過長度變化獲得相同的Tm，并在電泳上有所區別。
• 直接測序的引物設計原則是：引物不能含有CpG位點；引物含有足夠多的C（不和G相連）；采用巢式引物
• 基因甲基化區域選擇原則：如果是一個首次檢測的基因，首先，選擇啟動子部位；第二，選擇足夠多的CpG位點；第三、選擇200堿基以上區域，且GC超過50%
• 通過1.8％瓊脂糖凝膠或15％聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測PCR擴增后的結果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產生擴增產物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴增

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現“U”和“M”同時呈現陽性；建議使用GENMED基因甲基化程度定量分析試劑盒（20024.3）予以分析
• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 建議使用軟件測算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）
• 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 本公司提供甲基化特異性引物設計服務
• 本公司同時提供GENMED數字化表觀基因組完全分析（全部甲基化基因）技術試劑盒和外包服務（90002）
• 本公司提供系列甲基化分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定轉化保證
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定反應產量高