細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色試劑盒產品說明書（中文版）

 

主要用途

細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性染色試劑是一種旨在使用偶聯偶氮技術，在酸性環境和酒石酸存在的情況下， 呈現出紫紅色沉淀現象，來分析細胞樣本中抗酒石酸酸性磷酸酶表達的權威而經典的技術方法。該技術經過精心改良、成功實驗證明的。主要適用于動物原生代或培養細胞尤其是骨髓細胞和破骨細胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性檢測。可用于骨質細胞病理生理的研究的鑒定。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，靈敏牢固，顯色清晰。

 

技術背景

 

抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRAP）是一種在哺乳動物內表達的糖化單體金屬蛋白酶，970多堿基，320多氨基酸，分子量為35kD。作為破骨細胞的標志，抗酒石酸酸性磷酸酶與破骨細胞調節的骨resorption活性和骨生成代謝有關。抗酒石酸酸性磷酸酶是以酶原形式合成，通過蛋白酶裂解和還原后活化。在酸性環境下，催化磷酸酯鍵的水解，產生醇和釋放磷酸。其特征性為酒石酸抗性而與其它酸性磷酸酶區別。抗酒石酸酸性磷酸酶在破骨細胞（osteoclast）、活化的巨噬細胞、神經細胞以及懷孕期的豬內皮層子宮內膜（endometrium）高度表達。在網狀內皮組織增殖（leukaemic reticuloendotheliosis）或毛細胞性白血病（hairy cell leukaemia）、戈謝病（Gaucher’s disease）、愛茲性腦病（HIV-induced encephalopathy）、骨巨細胞瘤（osteoclastoma）、骨質疏松癥（osteoporosis）和代謝性骨病等病人體內抗酒石酸酸性磷酸酶顯著增高。基于底物萘酚AS-MX磷酸鹽（naphthol AS-MX phosphate），在酸性環境和酒石酸（tartrate）存在的條件下，酸性磷酸酶催化其水解，釋放出萘酚（naphthol-AS），進而與重氮鹽耐曬紅紫（Fast red violet）偶聯，于是在酶的活動處形成不溶性紫紅色沉淀的偶氮染料，由此證明抗酒石酸酸性磷酸酶活性。其反應體系為：

 

TRAP

naphthol AS-MX phosphate  ＋  H2O  →  naphthol AS  ＋  phosphate

tartrate

 

naphthol AS  ＋  Fast red violet  →  azo dye

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）   40毫升

固著液（Reagent B）   10毫升

反應液（Reagent C）  200微升

染色液（Reagent D）   20毫升

產品說明書    1份

 

保存方式

 

保存反應液（Reagent C）和染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反復凍融，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

甲基綠復染試劑盒（40010）：用于常規染色后復染

1.5毫升離心管：用于配制染色工作液的容器

恒溫培養箱：用于反應孵育

光學顯微鏡：用于細胞染色后觀察分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將試劑盒里的反應液（Reagent C）和染色液（Reagent D）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里等待溶化，并避光。然后移取1毫升染色液（Reagent D）到1.5毫升離心管，加入10微升反應液（Reagent C），充分混勻后，標記為染色工作液，室溫下，置入暗室。然后進行下列操作：

 

操作一：細胞載玻片染色

• 樣本固著處理

 

• 取出待測的細胞載玻片 
• 小心加上200微升清理液（Reagent A）在載玻片上，鋪滿整個樣品表面
• 小心移去載玻片上的清理液（Reagent A）
• 小心加上200微升固著液（Reagent B），鋪滿整個樣品表面
• 室溫下，孵育2分鐘
• 小心移去載玻片上的固著液（Reagent B）
• 小心加上200微升清理液（Reagent A），清洗樣品表面
• 小心移去載玻片上的清理液（Reagent A）
• 重復實驗步驟7至8一次

二、樣本染色處理

• 小心加上200微升染色工作液，鋪滿整個載玻片樣品表面
• 在37℃恒溫培養箱孵育15分鐘；或直至可見紫紅色（注意：避免光照）
• 小心移去載玻片上的染色工作液
• 室溫下，加上200微升清理液（Reagent A），清洗樣品表面
• 小心移去載玻片上的清理液（Reagent A）

 

• 樣本復染處理（選擇步驟）

 

• 樣本復染處理（甲基綠）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在一般光學顯微鏡下觀察：陽性細胞呈現紫紅色，背景黃色，核為綠色

 

操作二：24孔細胞培養板染色

一、樣本固著處理

 

1．小心抽去24孔細胞培養板里的培養液

2．每孔加入400微升清理液（Reagent A），清洗生長中的細胞表面

3．小心抽去每孔里的清理液（Reagent A）

4．每孔加入400微升固定液（Reagent B），覆蓋整個生長表面

5．在室溫下孵育2分鐘

6．小心抽去固定液（Reagent B）

7．每孔加入400微升清理液（Reagent A），清洗細胞表面

8．小心抽去清理液（Reagent A）

9．重復實驗步驟7和8兩次

二、樣本染色處理

• 小心加入400微升染色工作液，覆蓋整個生長表面
• 在37℃恒溫培養箱孵育15分鐘；或直至可見紫紅色（注意：避免光照）
• 小心抽去染色工作液
• 小心加入400微升清理液（Reagent A）
• 室溫下孵育2分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent A）

 

三、 樣本復染處理（選擇步驟）

 

• 樣本復染處理（甲基綠）
• 小心加入100微升清理液（Reagent A）
• 即刻在一般光學顯微鏡下觀察：陽性細胞呈現紫紅色，背景黃色，核為綠色

 

注意事項

 

• 本產品為50次操作（細胞載玻片）和25次（1個24孔板）操作
• 操作時，須帶手套
• 染色工作液配制后，即刻使用，不得超過1小時
• 染色工作液根據需要配制，每毫升，可以染色5個樣本
• 試劑溶液在樣品表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿樣品表面
• 細胞固定建議不要超過2分鐘，以免酶活性降低
• 如果樣品中酶活性較低，細胞染色可以延長至45分鐘
• 細胞染色注意不要過度
• 直接封片處理，不要使用有機溶劑（乙醇、二甲苯等），否則會使染色褪色
• 細胞染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察 
• 本公司提供系列組織細胞酶活性染色試劑產品

 

 

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定顯色清晰