細胞乙酰化組蛋白H3染色質免疫沉淀分析試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞乙酰化組蛋白H3染色質免疫沉淀分析（CHIP）試劑是一種旨在通過甲醛交聯、物理或化學處理細胞核以及染色質，從而運用特異抗體結合免疫沉淀，然后萃取DNA，擴增分析，來確定乙酰化組蛋白H3結合蛋白的目標DNA序列的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于后續組蛋白H3乙酰化圖譜的微陣列分析。廣泛應用于體內定性檢測各種動物細胞與乙酰化組蛋白H3相關的活性基因或DNA結合序列以及組蛋白H3乙酰化和DNA的相互作用等。產品即到即用，抗體配置，性能穩定，操作便捷，反應敏感，結合顯著，重復性好。

 

技術背景

 

DNA和蛋白質的相互作用是調控細胞反應過程的要素之一。染色質免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活體內（in vivo）DNA和蛋白質的相互作用的最新最有力的工具：用于分析染色質結構動力學、轉錄因子調節、以及表觀遺傳學變異等。CHIP技術通過三大步驟實現：第一，甲醛固定后染色質分離和斷片；第二，運用特異蛋白之抗體，免疫共沉淀結合蛋白（包括轉錄因子、聚合酶、組蛋白等）的染色質片斷；第三，分析目標DNA和蛋白的修飾。其中轉錄因子作為調節蛋白，通過結合核DNA，以達到控制基因表達。組蛋白是高度保守的核蛋白，作為核DNA組織成染色質的框架。組蛋白的轉譯后修飾，包括乙酰化、磷酸化、甲基化、ADP核糖基化（ADP ribosylation）和泛素化（Ubiquitination）等，幫助調控DNA轉錄、修復、重組和復制等。由組蛋白乙酰轉移酶催化的組蛋白乙酰化修飾發生在多個保守賴氨酸的氨基基團。組蛋白H3乙酰化是染色體的表觀遺傳標記，作用于調控各種細胞生理過程，包括基因轉錄激活、染色質組裝、細胞繁殖、以及腫瘤形成等。

 

產品內容

 

清理液（Reagent A） 300毫升

固著液（Reagent B）      100毫升

終止液（Reagent C）       10毫升

裂解液（Reagent D）  50毫升

核溶液（Reagent E）  10毫升

稀釋液（Reagent F）  10毫升

結合液（Reagent G）   1毫升

抗體液（Reagent H） 500微升

低鹽液（Reagent I）  10毫升

高鹽液（Reagent J）  10毫升

平衡液（Reagent K）  10毫升

緩沖液（Reagent L）  22毫升

洗脫液（Reagent M）       10毫升

解聯液（Reagent N）  1.2毫升

酶解液（Reagent O） 100微升

萃取液（Reagent P）  10毫升

濃縮液（Reagent Q）        3毫升

沉淀液（Reagent R）  25毫升

凈化液（Reagent S）  25毫升

擴增液（Reagent T） 300微升

補充液（Reagent U）   1毫升

產品說明書       1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent D）、核溶液（Reagent E）、稀釋液（Reagent F）、結合液（Reagent G）、抗體液（Reagent H）、解聯液（Reagent N）、酶解液（Reagent O）、萃取液（Reagent P）、濃縮液（Reagent Q）和擴增液（Reagent T）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 有效保證6月

 

用戶自備

 

特異引物：用于目標DNA的擴增或測序

1.5毫升離心管：用于樣品反應操作和保存的容器

2毫升離心管：用于樣品反應操作和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于脫離細胞

恒溫水槽：用于孵育反應物

震蕩器：用于混勻反應物

4℃微型臺式離心機：用于沉淀樣品

4℃臺式離心機：用于沉淀樣品

平式搖蕩儀或搖床：用于孵育和混勻反應

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細胞

超聲儀：用于裂解組織細胞核

PCR儀：用于擴增反應

電泳儀：用于檢測擴增產物

 

實驗步驟

 

實驗開始前，準備好待測細胞的預處理：藥物處理等。同時將－20℃保存的試劑置于冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

• 細胞核分離

 

（一）貼壁細胞核分離

 

• 準備100mm細胞培養皿或75cm²細胞培養瓶的細胞，直至生長到80至90％鋪滿率（1 X 10⁷細胞）
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）小心加入10毫升清理液（Reagent A），鋪滿生長表面
• （選擇步驟）小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入10毫升室溫預熱的固著液（Reagent B）
• 置于搖床，室溫下（25℃）孵育15分鐘，速度為50RPM
• 加入1毫升室溫預熱的終止液（Reagent C）
• 繼續置于搖床，室溫下（25℃）孵育5分鐘，速度為50RPM
• 小心抽去含有終止液（Reagent C）的固著液（Reagent B）
• 小心加入10毫升預冷的清理液（Reagent A），鋪滿生長表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 即刻用細胞刮脫棒刮脫細胞
• 轉移到15毫升錐形離心管
• 加入5毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟14至16一次
• 加入5毫升預冷的裂解液（Reagent D），混勻
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• （選擇步驟）即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• （選擇步驟）在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約5下）（注意：參見注意事項8）
• （選擇步驟）將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液 
• 加入1毫升核溶液（Reagent E），混勻顆粒群
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• 置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊20秒，間隙10秒冷卻，重復3次（注意：根據DNA片段大小，增加超聲次數）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液分裝到10個2毫升離心管（100微升/管）
• 其中： 1）選擇1管進行1：50稀釋后，測定OD260，確定DNA含量，使所有樣品的檢測濃度調整一致（注意：建議OD260＝0.1為佳）

2）或選擇1管進行蛋白濃度檢測，使所有樣品的檢測濃度調整一致（注意：蛋白總量1至5毫克為佳；建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

3）或選擇1管進行去交聯以及電泳鑒定超聲處理的DNA片段（0.3至1.5kb）（注意：參見注意事項9）

• 選擇1管繼續后續操作，其余的保存在－70℃冰箱里
• 加入900微升稀釋液（Reagent F）
• 進入實驗步驟二繼續

 

（二）懸浮細胞核分離

 

• 準備75cm²細胞培養瓶的懸浮細胞（1 X 10⁷細胞）
• 轉移到50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升室溫預熱的固著液（Reagent B），混勻
• 平放置于搖床，室溫下（25℃）孵育15分鐘，速度為100RPM
• 加入500微升室溫預熱的終止液（Reagent C）
• 繼續平放置于搖床，室溫下（25℃）孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟14至16二次
• 加入5毫升預冷的裂解液（Reagent D），混勻
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• （選擇步驟）即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• （選擇步驟）在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約5下）（注意：參見注意事項8）
• （選擇步驟）將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液 
• 加入1毫升核溶液（Reagent E），混勻顆粒群
• 置于冰槽里孵育10分鐘
• 置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊20秒，間隙10秒冷卻，重復3次（注意：根據DNA片段大小，增加超聲次數）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液分裝到10個2毫升離心管（100微升/管）
• 其中： 1）選擇1管進行1：50稀釋后，測定OD260，確定DNA含量，使所有樣品的檢測濃度調整一致（注意：建議OD260＝0.1為佳）
  • 或選擇1管進行蛋白濃度檢測，使所有樣品的檢測濃度調整一致（注意：蛋白總量1至5毫克為佳；建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

3）或選擇1管進行去交聯以及電泳鑒定超聲處理的DNA片段（0.3至1.5kb）（注意：參見注意事項9）

• 選擇1管繼續后續操作，其余的保存在－70℃冰箱里
• 加入900微升稀釋液（Reagent F）
• 進入實驗步驟二繼續

 

• 結合反應

 

• 加入60微升結合液（Reagent G）
• 平放置于4℃搖床孵育1小時，速度為100RPM
• 放進4℃臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到2個新的2毫升離心管（每管500微升：1管為無抗體對照；1管為抗體處理管）
• 加入50微升抗體液（Reagent H）到抗體處理管
• 將對照和抗體管平放置于4℃搖床孵育16小時，速度為100RPM
• 加入40微升結合液（Reagent G）到抗體處理管
• 將對照和抗體管平放置于4℃搖床孵育2小時，速度為100RPM
• 將抗體管放進4℃臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升低鹽液（Reagent I）到抗體管，混勻
• 平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升高鹽液（Reagent J）到抗體管，混勻
• 平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升平衡液（Reagent K）到抗體管，混勻
• 平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升緩沖液（Reagent L）到抗體管，混勻
• 平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM
• 放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟23至26一次
• 加入250微升洗脫液（Reagent M）到抗體管，混勻（注意：如果洗脫液（Reagent M）為乳白色，使用前，須溫育至澄清，才可使用）
• 平放置于搖床，室溫下孵育15分鐘，速度為100RPM
• 放進4℃微型臺式離心機離心3分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的2毫升離心管
• 重復實驗步驟28至31一次
• 小心移取上清液合并到上述2毫升離心管（注意：可以暫時停止，存放在－20℃，次日繼續）

 

• DNA萃取

 

• 分別加入50微升解聯液（Reagent N）到抗體處理管和無抗體對照管，混勻
• 置于65℃恒溫水槽孵育2小時
• 分別加入5微升酶解液（Reagent O）
• 置于55℃恒溫水槽孵育2小時
• 室溫下靜置15分鐘
• 分別加入500微升萃取液（Reagent P）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 分別移出450微升上層液相溶液到2個新的2毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 分別加入150微升濃縮液（Reagent Q）到新的離心管
• 分別加入1.2毫升沉淀液（Reagent R）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進微型臺式微型離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 分別加入1毫升凈化液（Reagent S）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 分別加入50微升緩沖液（Reagent L）
• 溶解后放進－20℃冰箱保存

 

• PCR擴增

 

• 將擴增液（Reagent T）和補充液（Reagent U）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對一個樣本，每次移出15微升擴增液（Reagent T）到PCR管
• 加入2微升上述結合實驗中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入1微升用戶自備的特異性的引物F和引物R（各350納克或25微摩爾）
• 再加入7微升補充液（Reagent U）（反應總量為25微升）
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項10）
• 即刻進行熱啟動PCR反應：

 

溫度（℃）	時間	循環
95	2分鐘	1
95 Tm 72	30秒 1分鐘 30秒	35
72	5分鐘	1

 

• 反應完畢后，移取5微升進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳
• 如果進行測序鑒定，膠回收PCR產物（建議使用高質純化一步法膠回收試劑盒；20051.1）
• 分別移出2微升反應液到2個不同的新的1.5毫升離心管（每微升100納克）
• 加入1微升用戶自備的特異性巢式引物F（每微升350納克）到其中一個1.5毫升離心管，作好標記
• 加入1微升用戶自備的特異性巢式引物R（每微升350納克）到另一個1.5毫升離心管，作好標記
• 進行后續的直接測序反應

 

注意事項

 

• 本產品為10次（1 X 10⁷細胞/次）操作
• 操作時，須戴手套
• 如果使用胰酶脫離貼壁細胞，脫離后按照懸浮細胞核分離步驟操作
• 抗體液（Reagent H）是特異性兔多克隆抗乙酰化組蛋白H3抗體，可以識別17kDa的乙酰化組蛋白；避免反復凍融
• 固著處理必須在室溫下進行，其余的操作均須在4℃狀態進行
• 嚴格按照操作規程進行
• 建議使用無抗體對照
• 通常勻化次數為80下達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
• 通常超聲處理后的DNA片段大小為0.3至1.5kb；如果使片段小于1.0kb，增加超聲次數或功率即可。電泳鑒定前，加入10微升解聯液（Reagent N）到1管100微升超聲處理后樣品，65℃孵育4小時，移取20微升進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。其標準片段電泳圖象如下：泳道1為DNA標準樣；泳道2為未經超聲處理樣品；泳道3為超聲處理后樣品；泳道4為強化超聲處理后樣品

 

• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 建議使用軟件測算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）
• 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 本公司提供系列CHIP研究產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶