冰凍切片半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性原位熒光染色檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

冰凍切片半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性原位熒光染色檢測試劑是一種旨在通過半胱氨酸蛋白酶-3抑制劑DEVD-FMK，與熒光染料FITC偶聯作為探針，自由進入細胞內，不可逆地結合活化的半胱氨酸蛋白酶-3，其熒光的增強或減弱說明酶活性的變化，進而分析細胞凋亡的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種冰凍組織內半胱氨酸蛋白酶-3活性檢測。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩定。

技術背景

細胞凋亡是細胞遵循特定程序的自殺，一種進化保留的形式。其程序的主要元素是蛋白水解酶，即半胱氨酸蛋白酶的瀑布式反應：從激發凋亡信號，到酶的裂解活化，最終導致細胞瓦解。半胱氨酸蛋白酶家屬是絲氨酸蛋白水解酶，其活化的酶由2個20Kd的大單體和2個10Kd的小單體組成2個異構二聚體。半胱氨酸蛋白酶家屬分成三大分支：啟動、擴增和執行。受體激活酶的啟動，例如半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）；啟動性酶或線粒體分子激活擴增反應，例如半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）；最后上游的酶激活下游的酶執行，例如半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）。半胱氨酸蛋白酶特異性地識別目標底物的4個氨基酸殘基，包括天門冬氨酸。使用熒光標記的特異性底物可以探測半胱氨酸蛋白酶活性。綠色熒光標記的抑制劑，FITC-DEVD- FMK，是天冬氨酰-谷氨酰-纈氨酰-天冬氨酸（Aspaspartatylglutamyl valylaspartic acid；DEVD）熒光甲基酮（fluoromethyl ketone；FMK）的異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocynate；FITC）衍生物。該抑制劑進入細胞后，與活化半胱氨酸蛋白酶的大單體上絲氨酸殘基二價共鍵結合，抑制半胱氨酸蛋白酶-3的活性，而未結合的熒光標記彌散出胞外被洗脫。含有熒光標記的細胞進行熒光定性或定量檢測。

產品內容

染色液（Reagent A）     25微升

稀釋液（Reagent B）     2.5毫升

清理液（Reagent C）     30毫升

固著液（Reagent D）     10毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細胞熒光定性分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）室溫下預熱。然后移出2微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入200微升稀釋液（Reagent B），混勻后，室溫下靜置，并標記為染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

• 準備4片待測的厚為10微米的未經固著處理的冰凍切片（注意：建議使用異戊烷快速冷凍制片）
• 置于室溫下，小心加上200微升預冷的清理液（Reagent C），鋪滿整個切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 小心加上50微升室溫預熱的含有染色液（Reagent A） 和稀釋液（Reagent B）的染色工作液，鋪滿整個切片表面
• 在37℃濕潤培養箱里，孵育60分鐘（注意：避免液體蒸發；可以蓋上蓋玻片孵育）
• 小心移去切片上的染色工作液，避免光照
• 小心加上200微升清理液（Reagent C），鋪滿整個切片表面
• 小心移去切片上的清理液（Reagent C）
• 小心加入200微升固著液（Reagent D）
• 室溫下（25℃），孵育15分鐘
• 小心移去固著液（Reagent D）
• 小心加上200微升清理液（Reagent C） 
• 小心移去 清理液（Reagent C）
• 放上蓋玻片或封片
• 即刻在共聚焦或倒置熒光顯微鏡下進行觀察 ：濾波器激發波長490nm，散發波長530nm ――如果綠色熒光強度顯著增強，表明半胱氨酸蛋白酶-3活性增強，細胞凋亡陽性

注意事項

• 本產品為50次（50微升工作液）操作
• 所有操作均須無菌狀態下進行
• 操作時，須戴手套
• 建議使用正常組織切片作為陰性對照，顯示微弱的背景信號
• 建議染色完成后，即刻進行熒光檢測分析
• 孵育時，必須避免光照
• 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶熒光染色分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定熒光清晰