石蠟切片組織細(xì)胞色素C免疫熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

石蠟切片組織細(xì)胞色素C免疫熒光檢測(cè)試劑是一種旨在使用標(biāo)準(zhǔn)化的化學(xué)分離石蠟方法和抗細(xì)胞色素C單克隆抗體以及熒光染料綴合物二抗的應(yīng)用，在線粒體特異性熒光染料的幫助下，通過(guò)熒光顯微鏡分析存檔中的石蠟包埋的組織切片中細(xì)胞區(qū)室（線粒體和細(xì)胞漿）的細(xì)胞色素C的分布狀態(tài)，從而觀察分析細(xì)胞凋亡的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于各種動(dòng)物和人體組織石蠟包埋切片的細(xì)胞色素C分析。廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

 

技術(shù)背景

 

細(xì)胞色素C（CYTOCHROME C）在細(xì)胞凋亡中扮演著重要作用。細(xì)胞色素C位于線粒體內(nèi)外膜之間。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，它從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞漿里，引起一系列的信號(hào)通道的下游反應(yīng)。通常使用免疫組化方法，即通過(guò)不同波長(zhǎng)的熒光染料的重疊染色，檢測(cè)其分布，反映細(xì)胞凋亡和細(xì)胞通路等。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

脫蠟液（Reagent A）             150毫升

補(bǔ)水液A（Reagent B）     50毫升

補(bǔ)水液B（Reagent C）     50毫升

補(bǔ)水液C（Reagent D）     50毫升

補(bǔ)水液D（Reagent E）     50毫升

清理液（Reagent F）         20毫升

修復(fù)液（Reagent G）          2毫升

封阻液（Reagent H）          2毫升

抗體液（Reagent I）          1毫升

染色液（Reagent J）          1毫升

重染液（Reagent K）         10微升

抗淬滅液（Reagent L）        500微升

強(qiáng)化液（Reagent M）    100毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

 

保存方式

 

保存修復(fù)液（Reagent G）、封阻液（Reagent H）、抗體液（Reagent I）、染色液（Reagent J）、重染液（Reagent K）和抗淬滅液（Reagent L）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；抗體液（Reagent I）和染色液（Reagent J）嚴(yán)禁反復(fù)凍融； 染色液（Reagent J）、復(fù)染液（Reagent K）和抗淬滅液（Reagent L）避免光照；有效保證6月

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于配制重染工作液的容器

蓋玻片：用于封片孵育

小型染色缸：用于脫蠟的操作

烘箱：用于脫蠟處理

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細(xì)胞熒光觀察

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 脫蠟處理

 

• 取出10片待測(cè)的10微米厚的石蠟包埋的組織切片 
• 放進(jìn)80℃烘箱，孵育30分鐘
• 室溫下靜置15分鐘
• 按下表依次放進(jìn)小染色缸里孵育

染色缸	孵育時(shí)間
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
50毫升補(bǔ)水液A（Reagent B）	3分鐘
50毫升補(bǔ)水液B（Reagent C）	3分鐘
50毫升補(bǔ)水液C（Reagent D）	3分鐘
50毫升補(bǔ)水液D（Reagent E）	3分鐘

 

• 小心移去切片上的補(bǔ)水液D（Reagent E）
• 小心加上200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

 

二、樣品預(yù)處理

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作：

• （選擇步驟）將切片置于100毫升燒杯，加入50毫升強(qiáng)化液（Reagent M）
• （選擇步驟）放進(jìn)微波爐里加熱5分鐘：其中15秒煮沸后，間隙15秒后再煮沸，直至5分鐘
• （選擇步驟）室溫下，冷卻20分鐘
• 加入200微升修復(fù)液（Reagent G）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去修復(fù)液（Reagent G）
• 空氣中晾干
• 加入200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent F）
• 加入200微升封阻液（Reagent H）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育60分鐘
• 小心抽去封阻液（Reagent H）

 

• 樣品染色處理

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的重染液（Reagent K）置入冰槽里融化，然后分別移出100微升清理液（Reagent F）和1微升重染液（Reagent K）到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為重染工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 加入100微升抗體液（Reagent I）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 蓋上蓋玻片，室溫下孵育2至16小時(shí)（注意：避免氣泡；參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
• 小心移去蓋玻片，抽去抗體液（Reagent I）
• 加入200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent F）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步4至6二次
• 加入100微升染色液（Reagent J）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育30分鐘，避免光照（注意：避免氣泡）
• 小心抽去染色液（Reagent J）
• 加入200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent F）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步11至13二次
• 加入100微升重染工作液在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去復(fù)染工作液
• 加入200微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent F）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步18至20二次
• 加入50微升抗淬滅液（Reagent L）
• 蓋上蓋玻片或封片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察

 

	染色液（Reagent J）	重染液（Reagent K）	合并
熒光染料	異硫氰酸熒光素（FITC）	MitoTracker RED	――
熒光顏色	綠色	紅色	桔黃色
激發(fā)波長(zhǎng)	488nm	579nm	――
散發(fā)波長(zhǎng)	530nm	599nm	――
作用	細(xì)胞色素C顯示	線粒體顯示	線粒體/細(xì)胞色素C重疊

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為10次操作
• 操作時(shí)須戴手套，以防污染
• 石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時(shí)，否則造成樣品支離破碎
• 所有操作在室溫下進(jìn)行
• 每次更換試劑溶液時(shí)，保持切片面基本晾干。空氣中晾干狀態(tài)為沒(méi)有水滴，呈濕潤(rùn)狀態(tài)，可見(jiàn)反光
• 試劑溶液在切片表面時(shí)，避免有氣泡存在，同時(shí)確保鋪滿切片表面
• 染色和重染孵育時(shí)，須避免光照
• 抗體液（Reagent I）孵育，可以持續(xù)16小時(shí)
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光顯微鏡觀察 
• 本公司提供系列細(xì)胞色素C檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰