組織半胱氨酸蛋白酶-8活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

組織半胱氨酸蛋白酶-8活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)四肽化合物底物Ac-IETD-pNA受到半胱氨酸蛋白酶-8的水解，釋放黃色硝基苯胺，即采用比色法來(lái)測(cè)定組織裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲(chóng)等）半胱氨酸蛋白酶-8（CASPASE-8）的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

半胱氨酸蛋白酶（Cysteine-requiring Aspartate protease；CASPASE），或稱(chēng)半胱天冬蛋白酶，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一類(lèi)蛋白酶家屬。半胱氨酸蛋白酶－8（CASPASE-8；EC3.4.22.61）是半胱氨酸蛋白酶家屬中細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)啟動(dòng)蛋白（initiator）之一。其又稱(chēng)FLICE（FADD like-interlukin-1 β-converting enzyme；FADD類(lèi)白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)換酶）、MACH （MORT1-associated CED-3 homolog；MORT相關(guān)性秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞死亡基因數(shù)3同源體）和Mch5 （mammalian CED homolog 5；秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞死亡基因哺乳動(dòng)物同源體5）等。半胱氨酸蛋白酶－8前體為55kd（470氨基酸），切離后激活而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。通過(guò)間接與細(xì)胞膜受體發(fā)生聯(lián)系，將細(xì)胞膜信號(hào)傳遞轉(zhuǎn)化到細(xì)胞漿內(nèi)。其底物之一是多聚ADP-核糖多聚酶（poly（ADP-ribose）polymerase；PARP）等。半胱氨酸蛋白酶-8的活性檢測(cè)用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞或組織凋亡的啟動(dòng)狀況，基于人工合成的四肽化合物底物Ac-IETD-pNA（acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-p-Nithoaniline；乙酰異亮氨酰谷氨酰蘇氨酰天冬氨酰硝基苯胺）受到半胱氨酸蛋白酶-8的水解，釋放有色硝基苯胺（405nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量測(cè)定半胱氨酸蛋白酶-8的活性。半胱氨酸蛋白酶-8反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

CASPASE-8

Ac－IETD－pNA       →          Ac－IETD  +   pNA

                                （黃色）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）   2毫升

陰性液（Reagent D）     1毫升

底物液（Reagent E）   220微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

 

用戶(hù)自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

液氮罐：用于組織樣品深凍處理

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于樣品比色測(cè)定的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品制備

 

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B） 
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/em>）
• 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 移取5微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里備用
• 或放進(jìn)冰槽里，繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好藥物處理的待測(cè)樣品
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)405nm，并置零 

 

• 活性測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取85微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 分別加入5微升陰性液（Reagent D）或上述制備的待測(cè)樣品（100微克總蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入10微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育90分鐘（注意：可見(jiàn)反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黃色）
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)
• 活性計(jì)算：

 

• 酶標(biāo)儀檢測(cè)

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 90 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）]＝單位/分鐘/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/分鐘/毫克

 

• 比色皿檢測(cè)

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 90 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/分鐘/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/分鐘/毫克

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為21次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融 
• 反應(yīng)90分鐘后比色測(cè)定值通常升高達(dá)0.2以上
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/5微升；如果樣本酶活性過(guò)低，即90分鐘讀數(shù)過(guò)低，則可以延長(zhǎng)反應(yīng)孵育時(shí)間至16小時(shí)；其次增加樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 半胱氨酸蛋白酶-8單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾四肽化合物底物Ac-IETD-pNA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶-8酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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