組織a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性DNS比色法定量檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

組織a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性DNS比色法定量檢測試劑是一種旨在使用具有還原力的黃色3,5-二硝基水楊酸與受到a-淀粉酶中性環境下水解產生的還原基團分子反應，生成強烈吸光的3-氨基-5-硝基水楊酸，即采用比色法測定其還原后峰值的升高變化，以此測定樣品中a-淀粉酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種組織（人體、動物）等裂解萃取液樣品a-淀粉酶的活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

 

技術背景

 

淀粉酶（AMYLASE）屬于糖苷水解酶類（glycoside hydrolase）。淀粉酶通過水解方式，分解淀粉的α-1，4鏈接，釋放出葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等簡單糖分子。淀粉酶分成三類：α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α淀粉酶（EC 3.2.1.1），又稱為α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）或糖原酶（glycogenase），是鈣離子依賴性鈣金屬蛋白酶（calcium metalloenzyme），分解淀粉為葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等，為主要的消化酶，尤其在人體中，例如唾液和胰淀粉酶等。β淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖麥芽糖水解酶（1,4-α-D-glucan maltohydrolase）或糖基淀粉酶（saccharogen amylase），分解淀粉為葡萄糖等。植物、真菌、細菌等均能產生，而人體組織不含有。γ-淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷酶（Glucan 1,4-α-glucosidase）或溶酶體α-葡萄糖苷酶（lysosomal α-glucosidase），在酸性環境下分解淀粉為葡萄糖。淀粉是一種復雜分子，由多聚糖直鏈淀粉（amylose）和支鏈淀粉（amylopectin）構成。基于淀粉，在中性環境下，通過α-淀粉酶的水解，釋放出麥芽糖等含有游離的還原性基團（例如酮基等），進一步使用具有還原力的黃色3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic acid；DNS）與之反應，產生紅棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸（3-amino-5-nitrosalicylic acid），在分光光度儀（540nm波長）下測定，以定量分析α-淀粉酶的活性。其反應方式為：   

α-AMYLASE

Starch  +  H2O       →      reducing groups（maltose）

     

Maltose  +  3,5-Dinitrosalicylic acid  →  3-amino-5-nitrosalicylic acid  +  maltonic acid

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應液（Reagent D）   5毫升

底物液A（Reagent E）   5毫升

底物液B（Reagent F）  20毫升

補充液（Reagent G）  50毫升

標準液（Reagent H）     2毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存 在4℃冰箱里；底物液B（Reagent F），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.2毫升離心管：用于配制標準樣品的容器

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理

沸水裝置：用于反應物孵育

比色皿：用于比色測定的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

一、樣品準備

 

• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作（注意：后續操作須在2小時內完成）

 

二、測定準備

 

• 從-70℃取出待測樣品（例如細胞裂解懸液樣品等），置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長為540nm，并置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 測定開始前，移出800微升底物液B（Reagent F）到新的1.5毫升離心管，加入200微升底物液A（Reagent E），混勻后，置于冰槽里，標記為底物工作液（2次操作），放在暗室里備用。然后進行下列操作

 

• 標準樣品測定

 

• 準備好5個2.2毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入1毫升緩沖液（Reagent C）到1至5號管
• 移取1毫升標準液（Reagent H）到1號管，混勻
• 小心移取1毫升1號管稀釋的標準液（Reagent H）到2號管，混勻
• 小心移取1毫升2號管稀釋的標準液（Reagent H）到3號管，混勻
• 小心移取1毫升3號管稀釋的標準液（Reagent H）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

 

管號	緩沖液（Reagent C）	標準液（Reagent H）	標準麥芽糖濃度
1	1毫升	1毫升	15毫摩爾/升
2	1毫升	1毫升1號管	7.5毫摩爾/升
3	1毫升	1毫升2號管	3.75毫摩爾/升
4	1毫升	1毫升3號管	1.875毫摩爾/升
5	1毫升	0	0

 

• 分別移取500微升上述配制的系列標準液（Reagent H）到1.5毫升離心管
• 分別加入500微升上述配制的底物工作液
• 在沸水里孵育5分鐘 ，避免光照
• 在室溫下靜置15分鐘冷卻，避免光照
• 分別移取100微升上述反應液到新的比色皿
• 分別加入1毫升補充液（Reagent G），混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟8至14四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位；橫座標（X軸）為標準麥芽糖濃度（毫摩爾/升）

 

• 樣品和背景測定

 

• 移取200微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
• 加入50微升待測樣品（100微克裂解萃取蛋白）或補充液（Reagent G）
• 25℃溫度下，孵育3分鐘
• 分別加入250微升反應液（Reagent D），混勻
• 25℃溫度下，孵育3分鐘
• 分別加入500微升上述配制的底物工作液
• 在沸水里孵育5分鐘，避免光照
• 在室溫下靜置15分鐘冷卻，避免光照
• 分別移取100微升上述反應液到新的比色皿
• 分別加入1毫升補充液（Reagent G），混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 實際樣品吸光讀數：樣品吸光讀數－背景吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品對應麥芽糖濃度（毫摩爾/升）
• 測算樣品酶活性：

 

【根據標準曲線獲得樣品對應麥芽糖濃度（毫摩爾/升）X樣品稀釋倍數】÷3 （反應時間；分鐘）＝微摩爾MALTOSE/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾MALTOSE/毫克/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為25次操作，包括標準樣品測定
• 操作時，須戴手套
• 底物工作液注意避光
• 樣品檢測前，須溶解和澄清
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 測定值由低到高變化，表明有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量（本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• a-淀粉酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 6.9的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）釋放1微摩爾的麥芽糖分子
• 本公司提供系列淀粉酶學分析技術產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確