細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶-12活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶-12活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過四肽化合物底物Ac-ATAD-pNA，受到半胱氨酸蛋白酶-12的水解，釋放黃色對(duì)硝基苯胺，產(chǎn)生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）半胱氨酸蛋白酶-12（CASPASE-12）的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

半胱氨酸蛋白酶（Cysteine-requiring Aspartate protease；CASPASE），或稱半胱天冬蛋白酶，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一類蛋白酶家屬。半胱氨酸蛋白酶-12 （CASPASE-3；EC3.4.22.65）是半胱氨酸蛋白酶家屬中CED-3（Cell Death Gene Number 3；秀麗隱桿線蟲細(xì)胞死亡基因數(shù)3）分支的一種，與半胱氨酸蛋白酶-1結(jié)構(gòu)相似。半胱氨酸蛋白酶又稱為炎癥半胱氨酸蛋白酶，激活炎癥細(xì)胞因子，包括白介素（interleukin）1和18等。半胱氨酸蛋白酶-12分成功能性全長蛋白（full length；Csp12L）和無活性截?cái)嗟鞍祝╥nactive truncated form；Csp12S）兩種形式。半胱氨酸蛋白酶-12的活性檢測用來評(píng)價(jià)細(xì)胞或組織炎癥反應(yīng)的凋亡狀況。基于人工合成的四肽化合物底物Ac-ATAD-pNA（acetyl-Ala-Thr-Ala-Asp-p-Nithoaniline；乙酰丙氨酰蘇氨酰丙氨酰天冬氨酰對(duì)硝基苯胺）受到半胱氨酸蛋白酶-12的水解，釋放有色對(duì)硝基苯胺，在分光光度儀（405nm 波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定半胱氨酸蛋白酶-12的活性。半胱氨酸蛋白酶-12反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

CASPASE-12

Ac-ATAD-pNA       →          Ac-ATAD  +   pNA

                                （黃色）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）   2毫升

陰性液（Reagent D）     1毫升

底物液（Reagent E）   220微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

 

 

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品制備

 

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好上述制備的（藥物處理的）待測樣品
• 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 活性測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取85微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 分別加入5微升陰性液（Reagent D）或上述制備的待測樣品（50微克總蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入10微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育90分鐘（注意：可見反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見的黃色）
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 活性計(jì)算：

 

• 酶標(biāo)儀檢測

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 90 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 0.6 （光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

 

• 比色皿檢測

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（毫升，測定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 10.5（毫摩爾吸光系數(shù)）X 90 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為21次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
• 反應(yīng)90分鐘后比色測定值通常升高達(dá)0.2以上
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)90分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定90分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以延長反應(yīng)孵育時(shí)間至16小時(shí)；其次增加樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 半胱氨酸蛋白酶-12單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾四肽化合物底物Ac-ATAD-pNA所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶-12酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感