植物a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性EPS-G7酶偶聯(lián)比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

植物a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性EPS-G7酶偶聯(lián)比色法定量檢測試劑是一種旨在底物4,6-亞乙基4-硝基苯-麥芽庚（七）糖苷，受到a-淀粉酶和α-糖苷酶偶聯(lián)反應(yīng)水解后釋放出顯色產(chǎn)物對硝基苯酚，即采用比色法測定其吸光峰值的升高變化，以此測定樣品中a-淀粉酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種新鮮植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）等裂解萃取液樣品a-淀粉酶的活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

 

技術(shù)背景

 

淀粉酶（AMYLASE）屬于糖苷水解酶類（glycoside hydrolase）。淀粉酶通過水解方式，分解淀粉的α-1,4鏈接，釋放出葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等簡單糖分子。淀粉酶分成三類：α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α淀粉酶（EC 3.2.1.1），又稱為α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）或糖原酶（glycogenase），是鈣離子依賴性鈣金屬蛋白酶（calcium metalloenzyme），分解淀粉為葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等，為主要的消化酶，尤其在人體中，例如唾液和胰淀粉酶等。β淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖麥芽糖水解酶（1,4-α-D-glucan maltohydrolase）或糖基淀粉酶（saccharogen amylase），分解淀粉為葡萄糖等。植物、真菌、細菌等均能產(chǎn)生，而人體組織不含有。γ-淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷酶（Glucan 1,4-α-glucosidase）或溶酶體α-葡萄糖苷酶（lysosomal α-glucosidase），在酸性環(huán)境下分解淀粉為葡萄糖。淀粉是一種復(fù)雜分子，由多聚糖直鏈淀粉（amylose）和支鏈淀粉（amylopectin）構(gòu)成。植物和細菌產(chǎn)生大多數(shù)淀粉。在淀粉酶的催化作用下，分解產(chǎn)生簡單糖分子，作為能源儲存，植物用于光合作用。植物和細菌性淀粉酶常用于工業(yè)，包括烘培食物和乳制品的制造，以及酒精和紙材的生產(chǎn)。基于底物4,6-亞乙基4-硝基苯-麥芽庚（七）糖苷（4,6-ethylidene(G7)-1[4-nitrophenyl(G1)]-1,4-a-D-maltoheptaoside

EPS-PNP-G7)），通過α-淀粉酶的水解，轉(zhuǎn)化為亞乙基（ethylidene；EPS）和4-硝基苯-麥芽庚（七）糖苷（4-nitrophenyl(G1)]-1,4-a-D-maltoheptaoside；PNP-G7），進而在α-糖苷酶（α-glucosidase）的水解下，降解為葡萄糖和對硝基苯酚（4-nitrophenol），在分光光度儀（405nm波長）下測定，以定量分析α-淀粉酶的活性。其反應(yīng)方式為：

   

α-AMYLASE

EPS-PNP-G7       →      EPS   +    PNP-G7

 

    α-glucosidase

PNP-G7  +  H2O  →  glucose  +  4-nitrophenol

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A） 100毫升

裂解液（Reagent B） 100毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應(yīng)液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）      2毫升

補充液（Reagent F）   1毫升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）和裂解液（Reagent B）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent E），避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備和反應(yīng)操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.2毫升離心管：用于配制標(biāo)準(zhǔn)樣品的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

尼龍網(wǎng)（nylon mesh）：用于去除殘渣

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理

恒溫培養(yǎng)箱：：用于反應(yīng)物孵育

比色皿：用于比色測定的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

一、樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的5毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 置于冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下） 
• 準(zhǔn)備1個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或150微米的尼龍網(wǎng)（nylon mesh），置于15毫升錐形離心管上
• 將所有組織勻漿物移入到小型漏斗里過濾
• （選擇步驟）或者放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移取無渣液分裝到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作（注意：后續(xù)操作須在2小時內(nèi)完成）

 

二、測定準(zhǔn)備

 

• 從-70℃取出待測樣品（例如植物組織裂解懸液樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為405nm，并置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 樣品和背景測定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下，孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（注意：50微克總蛋白）或補充液（Reagent F）
• 在37℃溫度下，孵育5分鐘
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得背景和樣品吸光讀數(shù) 
• 測算樣品酶活性：

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 1（體系容量；毫升）]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 11.2（毫摩爾吸光系數(shù)）X 1（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照測定
• 操作時，須戴手套
• 底物液（Reagent E）注意避光
• 樣品檢測前，須溶解和澄清
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣品測定值高于背景測定值，表明有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• a-淀粉酶活性單位濃度定義：在37℃室溫下，pH 7.1的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的對硝基苯酚
• 本公司提供系列淀粉酶學(xué)分析技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確