組織鳥苷酸酶（GTPase）總活性定磷比色法定量檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

組織鳥苷酸酶（GTPase）總活性定磷比色法定量檢測試劑是一種旨在通過GTP酶反應系統中， 測定GTP水解產生的GDP過程中，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產生鉬藍顯色反應后吸光峰值的變化， 即采用比色法測定樣品酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物組織（人體和動物等）裂解懸液樣品GTP酶的總活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

 

技術背景

 

鳥苷三磷酸酶，又稱為GTP酶（guanosine triphosphatase；GTPase或GTP phosphohydrolase；EC3.6.5.），屬于鎂離子依賴性磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸鳥苷分解為二磷酸鳥苷和無機磷。GTP酶在嗅覺、味覺和光感覺信號通路、蛋白合成、細胞分化、蛋白質的膜轉位（translocation）以及囊泡轉運等方面具有重要調控作用。GTP酶受到異源三體G蛋白（heterotrimeric G protein）的調節。GTP酶有大型GTP酶和小型GTP酶。其中小型GTP酶（small GTPase），為Ras蛋白同源的單體蛋白家屬，分成5個亞群：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran；其中Rho又細分為RHOA、RAC1和CDC42。小型GTP酶在各種細胞信號通路中起著分子開關（molecular switch）的作用。基于底物GTP，受到組織細胞中的GTP酶的水解，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產生鉬藍顯色反應后，在分光光度儀下（660nm波長）產生吸光峰值的變化，由此定量分析GTP酶的總活性。其反應系統為： 

 

GTPase

GTP  +  H2O  →    GDP  +  Pi

 

Pi  +  Dye   →    Pi-dye complex

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）       10毫升

緩沖液（Reagent C）  25毫升

陰性液（Reagent D）    10毫升

反應液（Reagent E）   1毫升

顯色液（Reagent F）  30毫升

標準液（Reagent G）   3毫升

產品說明書      1份

 

 

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應液（Reagent E）和顯色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸； 有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于標準樣品和待測樣品制備和保存的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備

培養箱：用于反應孵育

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；顯色液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。

 

• 樣品準備

 

• 手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入適量的（500毫克組織需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA蛋白質濃度定量試劑盒－30031.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

二、測定準備

 

• 準備好上述待測樣品，置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀：波長為660nm，并置零  
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 按下表分別加入陰性液（Reagent D）和標準液（Reagent G）到每個離心管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

 

管號	陰性液（Reagent D）	標準液（Reagent G）	測定體系標準磷濃度
1	——	500微升	100微摩爾/升
2	100微升	400微升	80微摩爾/升
3	200微升	300微升	60微摩爾/升
4	300微升	200微升	40微摩爾/升
5	500微升	0	0

 

• 標準曲線測定

 

• 移取500微升上述配制的標準液到新的比色皿
• 在37℃溫度下孵育20分鐘
• 加入500微升顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟1至5四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準磷濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品背景測定

 

• 移取400微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入50微升待測樣品（總量100微克組織裂解萃取液蛋白） 
• 在37℃溫度下孵育20分鐘
• 加入500微升顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品背景對應磷濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品活性測定

 

• 移取400微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入50微升待測樣品（總量100微克組織裂解萃取液蛋白） 
• 在37℃溫度下孵育2分鐘
• 加入50微升反應液（Reagent E）
• 在37℃溫度下孵育20分鐘
• 加入500微升顯色液（Reagent F），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品活性對應磷濃度（微摩爾/升）

 

 

• 計算樣品活性

 

{[根據標準曲線獲得樣品活性對應磷濃度（微摩爾/升）—根據標準曲線獲得樣品活性對應磷濃度（微摩爾/升）]X 10（體系倍數）X樣品稀釋倍數}÷ 20（反應時間；分鐘）＝納摩爾磷/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾磷/毫克/分鐘

  

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
• 樣品忌用磷酸緩沖溶液 
• 反應測定值由低到高變化
• 如果用戶沒有660nm波長，可以使用600至660nm的任一波長替代
• 吸光讀數增高，表明具有酶活性
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供 BCA蛋白質濃度定量試劑盒30031.1）
• GTP酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠產生（釋放）1微摩爾磷所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列ATP酶類技術產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確