重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染試劑是一種旨在通過強烈的陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)載體，幫助重組的目標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA輕易通過單嗜性病毒包裝細胞的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA（例如莫羅尼氏鼠白血病病毒（MoMuLV）等）轉(zhuǎn)入單嗜性病毒包裝培養(yǎng)細胞系（例如人胚腎Bosc23細胞等）。可以被用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或暫態(tài)轉(zhuǎn)染。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，無核酶污染，配比優(yōu)化，操作簡捷，性能穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率達80至100％。

技術(shù)背景

LipofusinX由磷脂形成穩(wěn)定的微囊，其帶有強負電性的精胺基團，與陰離子DNA形成復(fù)合物，與細胞表面帶負電荷的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進入細胞，促進極性分子穿透細胞膜，具有超強的穿膜能力。血清干擾因素?zé)o損于攜帶外源性DNA高效進入細胞內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是正鏈RNA病毒，其基因組中有編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶（integrase）的基因，在這些酶的作用下病毒基因組RNA被逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，然后隨機整合在宿主細胞的染色體DNA上，并長期存在于宿主細胞基因組中。

在構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，由于大部分病毒的必需基因和包裝信號被治療基因取代，這樣產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒不能表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白，因此這種病毒載體已無能力復(fù)制和包裝成成熟的病毒顆粒。重組的已插入外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體必須先在體外一個經(jīng)過特殊改造和修飾的臨時性細胞（Packaging cell）中復(fù)制并包裝，成為含有外源基因的具有感染能力的病毒顆粒。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）                   40毫升

轉(zhuǎn)染液（Reagent B）                  100微升

強化液（Reagent C）                  100微升

產(chǎn)品說明書                                             1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

重組質(zhì)粒DNA：用于轉(zhuǎn)染的目標(biāo)DNA

病毒包裝細胞（例如Bosc23細胞）：用于目標(biāo)DNA轉(zhuǎn)染的宿主細胞

1.5毫升離心管：用于轉(zhuǎn)染液和DNA操作的容器

15毫升錐形離心管：用于病毒懸液操作的容器

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養(yǎng)液（12052）：用于轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)

實驗步驟

轉(zhuǎn)染實驗開始前，移取230微升清理液（Reagent A）到無菌的1.5毫升離心管，然后加入10微升轉(zhuǎn)染液（Reagent B），再加入10微升強化液（Reagent C），用1000微升槍頭輕輕上下抽吸混勻，成為轉(zhuǎn)染工作液。然后進行下列操作。

• 準(zhǔn)備1個25cm²細胞培養(yǎng)瓶（2.7 X 10⁶細胞）的病毒包裝細胞（例如Bosc23細胞等）
• 轉(zhuǎn)染前24小時，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脫離細胞一次（注意：此步驟重要）
• 重新鋪板到新的25cm²細胞培養(yǎng)瓶（注意：確保細胞完全均勻分離，避免形成細胞團快。此步驟重要）
• 轉(zhuǎn)染前細胞生長達到80％鋪滿率（注意：此步驟重要）
• 小心抽去細胞培養(yǎng)液
• 加入2毫升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A），鋪滿細胞生長表面，等待轉(zhuǎn)染
• 移取230微升清理液（Reagent A）到無菌的1.5毫升離心管
• 加入20微升用戶需轉(zhuǎn)染的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA（總量3微克），用1000微升槍頭輕輕上下抽吸混勻
• 用1000微升槍頭一滴一滴緩慢加入DNA混勻物到上述配制的轉(zhuǎn)染工作液里，再用槍頭輕輕上下抽吸混勻
• 混勻后，在室溫下靜置15分鐘，期間輕輕混勻數(shù)次
• 小心抽掉細胞培養(yǎng)瓶里的清理液（Reagent A）
• 輕輕加入1毫升清理液（Reagent A）到培養(yǎng)瓶里，鋪滿細胞生長表面
• 輕輕混勻含有DNA的轉(zhuǎn)染工作液，即刻輕輕緩慢加入所有500微升到細胞培養(yǎng)瓶里
• 輕輕搖動細胞培養(yǎng)瓶，使其混勻
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱，孵育3小時（注意：參見注意事項9）
• 小心抽掉含有轉(zhuǎn)染液的培養(yǎng)液（注意：參見注意事項10和11）
• 加入5毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱，孵育24小時
• 小心抽掉細胞培養(yǎng)液
• 加入2.5毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱，繼續(xù)孵育24小時（注意：如果細胞生長鋪滿率低于95％，增加培養(yǎng)24小時）
• 移取2.5毫升細胞培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管（如果載體攜帶beta－gal報告基因，貼壁細胞可以進行beta－gal染色，確定轉(zhuǎn)染效率；通常轉(zhuǎn)染效率達80至100％）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為500g（去除活細胞）
• 或進行針筒過濾器（0.45微米過濾膜）過濾
• 小心移取2.3毫升上清液分裝到2個1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存
• 或置于冰槽里即刻進行后續(xù)感染雙嗜性病毒包裝培養(yǎng)細胞系（例如PA317細胞等）

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次操作
• 整個操作須無菌操作
• 操作時，須戴手套
• 注意病毒操作安全
• 操作時使用的槍頭須使用帶濾芯的槍頭
• 建議使用高度純化且無內(nèi)毒素的載體DNA
• 根據(jù)用戶實際情況，建議使用空載體對照或報告基因標(biāo)記對照
• 建議使用的包裝細胞須經(jīng)過篩選，例如Bosc23細胞使用霉酚酸篩選，建議使用 Bosc23細胞克隆選擇培養(yǎng)基（12086）
• 孵育時建議將培養(yǎng)瓶密封，以防或避免轉(zhuǎn)染工作液蒸發(fā)
• 更換液體時，須小心，以防細胞松動或脫落
• 如果轉(zhuǎn)染孵育后，出現(xiàn)較多細胞松動和脫落，直接加入5毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24小時后，進行更換
• 本產(chǎn)品提供的成分配比優(yōu)化
• 如果轉(zhuǎn)染不理想，可以適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)染液、強化液和DNA用量
• 病毒懸液嚴(yán)禁凍融超過2次
• 本公司提供系列病毒試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)染效率高