血液總脂肪酶（lipase）活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

血液總脂肪酶（lipase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物三丁酸二巰基丙醇受到脂肪酶水解，釋放出巰基基團，使用Ellman試劑，產生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心改良、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體血液（血漿、血清等）樣品脂肪酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂質分子的酯鍵（ester bond）的水解。在人體中，其來源于胰腺產生。在消化系統中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），產生1個分子甘油（glycerol）和3個分子游離脂肪酸分子（fatty acid）。脂肪酶異常增高與胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、腎病、唾液腺炎癥、腸道阻塞等相關；異常降低則與胰腺中脂肪酶產生細胞的永久性損傷有關。脂肪酶的活性檢測是臨床診斷的指標之一。基于脂肪酶在水分子的參與下，催化三丁酸二巰基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，產生二巰基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并釋放出巰基基團（－SH），進而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反應系統為：

lipase

DMPTB  +  H2O  →  DMP  +  TB

 

DTNB  +  DMP -SH  →   TNB  +  DMP -S-S-TNB

 

產品內容

 

緩沖液（Reagent A） 10毫升

反應液（Reagent B）  1毫升

底色液（Reagent C）     500微升

補充液（Reagent D）     500微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存反應液（Reagent B）和底色液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent C）避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備

恒溫水槽：用于孵育反應

比色皿或96孔板：用于反應和比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

選擇一：血漿樣品

• 準備好肝素或ACD等抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

 

選擇二：血清樣品

1． 準備好不含抗凝劑的儲存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品，置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長412nm，間隔10分鐘，讀數4次（共30分鐘），并置零 
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

三、背景對照測定

 

• 移取910微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入40微升底色液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（30分鐘讀數－0分鐘讀數）

 

• 樣品測定

 

• 移取810微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent B）
• 加入40微升底色液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（30分鐘讀數－0分鐘讀數）

 

• 計算樣品活性

  

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 1（體系容量；毫升）]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數）X 30（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾DMPTB/分鐘

 

六、酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取205微升緩沖液（Reagent A）到所有孔里
• 加入25微升反應液（Reagent B）到樣品孔里
• 加入25微升陰性液（Reagent D）到背景對照孔里
• 分別加入10微升底色液（Reagent C）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升待測樣品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測，包括（0分鐘初始讀數和30分鐘讀數）
• 活性計算

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 30（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾DMPTB/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次（96孔板，包括20次樣品和20次背景對照）和5次（比色皿，包括5次樣品和5次背景對照）操作
• 本產品檢測范圍是40至1600毫單位/毫升
• 建議血液樣品采集后3小時內制備完成
• 操作時，須戴手套
• 每次樣品測定，需要背景測定一次
• 樣品須澄清，至關重要
• 樣品中避免含有EDTA、TWEEN20、NP40、巰基乙醇、DTT等，否則干擾檢測
• 孵育反應完成后即刻進行比色測定
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）水解1微摩爾三丁酸二巰基丙醇
• 正常脂肪酶的參考值：

小鼠血清809±15毫單位/毫升

大鼠血漿959±23毫單位/毫升

大鼠血清665±14毫單位/毫升

山羊血清44±1毫單位/毫升

牛血清80±1毫單位/毫升

人血清75±6毫單位/毫升

人血漿52±2毫單位/毫升

• 血液干擾因子如下：

未結合膽紅素大于20毫克/分升

結合膽紅素大于25毫克/分升

血紅蛋白大于2000毫克/分升

甘油三酯大于1000毫克/分升

甘油大于250毫克/分升

抗壞血酸大于50毫克/分升

乳糜脂肪大于1%

 

• 本公司提供系列醫學生化檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感