細(xì)胞果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（ALD）活性酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

細(xì)胞果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（ALD）活性酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和α-甘油磷酸脫氫酶的酶連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法來測(cè)定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲等）果糖-1,6-二磷酸醛縮酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose-bisphosphate aldolase；EC 4.1.2.13），簡(jiǎn)稱為醛縮酶（aldolase；ALD），是糖酵解通路中的成員之一，存在于所有動(dòng)物、植物和大部分微生物中。主要分為兩大類：I類在動(dòng)物和高等植物中存在，其特征是無需二價(jià)金屬輔因子參與；II類在原發(fā)細(xì)胞（primitive cell）包括酵母和細(xì)菌中存在，金屬輔因子必需。動(dòng)物組織的醛縮酶為同源四聚體，分子量約為160KD，主要有三種異構(gòu)體：A、B、C型，其催化的反應(yīng)產(chǎn)物均是看家基因相關(guān)性產(chǎn)物。發(fā)育胚胎、成年肌肉和紅細(xì)胞中產(chǎn)生A型醛縮酶；成年肝臟、腎臟和小腸產(chǎn)生B型醛縮酶；而腦組織、其它神經(jīng)組織以及平滑肌產(chǎn)生C型醛縮酶。醛縮酶催化果糖-1,6-二磷酸（fructose 1,6-bisphosphate；F-1,6-BP）的可逆性轉(zhuǎn)化反應(yīng)，又稱為醇醛縮合反應(yīng)（aldol reaction），產(chǎn)生3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde 3-phosphate；GA3P）和磷酸二羥丙酮（dihydroxyacetone phosphate；DHAP）。A型缺失將導(dǎo)致肌病和溶血性貧血；B型異常將引起遺傳性乳糖不耐受癥（hereditary fructose intolerance）。 基于果糖-1,6-二磷酸在醛縮酶的作用下，產(chǎn)生3-磷酸甘油醛后，通過磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase）和α-甘油磷酸脫氫酶（α－glycerol phosphate dehydrogenase）系統(tǒng)，測(cè)定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm 波長(zhǎng)），來定量分析果糖-1,6-二磷酸醛縮酶的總活性。其酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

Fructose-bisphosphate aldolase

fructose-1,6-bisphosphate  +  H2O   →  glyceraldehyde-3-phosphate  +  dihydroxyacetone phosphate

 

triosephosphate isomerase

 glyceraldehyde-3-phosphate   →    dihydroxyacetone phosphate   

 

α-glycerol phosphate dehydrogenase 

2 dihydroxyacetone phosphate  +  2 NADH    →  2 glycerol-3-phosphate  +  2 NAD^＋ 

 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

底色液（Reagent D）   2毫升

反應(yīng)液（Reagent E）     2毫升

陰性液（Reagent F）     1毫升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、底色液（Reagent D）和反應(yīng)液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent D）和反應(yīng)液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent D）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升底色液（Reagent D）
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測(cè)定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升底色液（Reagent D）
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)） 

 

五、計(jì)算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 2]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾果糖-1,6-二磷酸/分鐘

 

• 酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
• 分別加入25微升底色液（Reagent D）
• 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 2]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 

 

單位＝微摩爾果糖-1,6-二磷酸/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 建議使用比色皿測(cè)定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)光度測(cè)定
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘
• 光度測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 果糖-1,6-二磷酸醛縮酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾果糖－6－磷酸所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感