使用方法

1. 膠原酶儲存液的配制

向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS（Hank’s平衡鹽溶液，含Ca2+、Mg2+），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/ml（即1000×）的儲存液。然后用低蛋白結合性的0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝成小份量，然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍，避免反復凍融。其用于組織和細胞分散的常用濃度為：0.5-2.5mg/ml，用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml，需要根據特定的實驗條件或者參考相應的文獻資料確定所需的最佳工作濃度。

2．組織的分離

1）使用無菌手術刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊；

2）利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數次；

3）加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS，使其浸沒組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度；

4）于37℃孵育4-18h。消化時使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補充消化可以提高消化效率。

5） 已分散開的細胞可使用不銹鋼或尼龍網篩篩得，收集備用。未完全解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續孵育；

6）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數次；

7）細胞培養液重懸上述細胞，利用自動細胞計數器或其他方法計算活細胞密度。

8）于細胞培養皿上利用合適細胞培養基接種細胞。

3． 器官灌注

1）向37℃預熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶，另添加3mM的CaCl2有助于提高分離效率；

2）按照已優化的速率對相應的器官灌注膠原酶工作液；

3）將上述過程中回收的灌注液流經不銹鋼或尼龍網篩，從而將已解離的細胞或小片段組織塊與較大團塊分離開來，未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進一步孵育；

4）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數次；

5）細胞培養液重懸上述細胞，利用自動細胞計數器或其他方法計算活細胞密度。

6）于細胞培養皿上利用合適細胞培養基接種細胞。