Bio-Rad 微滴式數字PCR 新型冠狀病毒檢測方案
 
 
2019年12月底在武漢發現的新型冠狀病毒肺炎已傳播至國內13個省（區、市），截止2020年1月22日，累計報告新型冠狀病毒感染的肺炎確診病例549例，疑似137例，報告死亡病例累計17例。國外也陸續出現確診病例的報道。
世界衛生組織已正式將造成此次疫情的新型冠狀病毒命名為2019 新型冠狀病毒( 2019-nCoV )，并發布了針對疑似新型冠狀病毒感染造成嚴重急性呼吸道感染的臨床管理臨時指導意見。2019-nCoV是以前從未在人體中發現的冠狀病毒新毒株。目前新型冠狀病毒傳染源尚未找到。

Bio-Rad微滴式數字PCR技術（ddPCR）是第三代PCR技術，無需標準參照物質即可給出樣本的拷貝數濃度而非Ct值，其檢測結果為判讀提供量化的依據。根據LOB(limit of blank)和未知樣本的定量結果作出判讀，可避免人為錯誤，縮小灰區，提高檢出率。 
ddPCR獨有的微滴處理技術，使其對PCR擴增效率的變化不再敏感，不懼含有PCR抑制物樣本的挑戰。隨著疫情的變化以及流行病學調研的推進，更多類型的檢測乃至環境監測也可能需要進行，ddPCR的這一優勢會發揮作用。此外，如果新型冠狀病毒發生變異，病毒基因序列上引物、探針靶向位置出現SNV，ddPCR亦能克服引物、探針結合能力下降帶來的擴增效率變化，確保穩定檢出。不僅如此，還能根據樣本微滴熒光信號的變化，發現引物探針靶標區域可能出現變異的病例，為NGS測序分析病毒變異提供樣本，助力流行病學研究。

 
 
應用如下

2019- nCoV病毒檢測方法
疑似病人的快速取樣和檢測是防止疫情擴散的當務之急。目前新型冠狀病毒的診斷，是在符合疑似病例標準的基礎上，對痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等樣本進行熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測。中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所推薦選用針對新型冠狀病毒的開放讀碼框1ab（open reading frame, ORF1ab）、核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因區域的引物和探針序列：
Target 1（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Target 2（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'
在熒光定量PCR上的結果判斷：
陰性:無Ct值或Ct為40；
陽性：Ct值<37，可報告為陽性；
可疑：Ct值在37-40之間，建議重復實驗，若重做結果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。
數字PCR實驗，建議采用官方機構推薦的引物、探針序列，結合Bio-Rad ddPCR RNA一步法預混液，經優化反應條件后使用。實驗步驟如下圖：



部分參考文獻
 
 
參考文獻1：
D Zhou., Y Li., J Li., J Yu., H Yang et.al; Construction of Lentivirus-Based Reference Material for RT-PCR Detection of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus and Its Application in External Quality Assessment. J Nanosci Nanotechnol. 2019 Sep 1;19(9):5510-5516. doi: 10.1166/jnn.2019.16591.
內容簡述：
 
自2012年首次檢測到中東呼吸系統綜合癥冠狀病毒（MERS-CoV）以來，核酸擴增技術（NAT）一直是用于快速檢測MERS-CoV的最常用的技術。開發穩定、安全的陽性標準品以評估核酸擴增檢測的可靠性，并在不同的實驗室中執行外部質量評估（EQA）有重要的意義。在這項研究中，MERS-CoV RNA片段包括upE，ORF1b和N被包裝在人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）顆粒中。利用ddPCR方法，發現凍干的病毒樣顆粒（VLP）核酸在37°C或更低溫度下穩定，不僅可以安全地用作PCR檢測MERS-CoV的對照材料，而且還可以用作EQA的參考材料。在中國寧波國際旅行醫療中心組織的一次EQA中，有49家參與機構在使用各種商業診斷試劑盒和不同提取方法檢測MERS-CoV時，雖然有相對一致的結果，但同一樣品在不同實驗室報告的Ct值不同，這意味著需要對實驗室之間的RNA提取方法和/或PCR檢測條件進行標準化。
結論：
 
QX200可用于陽性標準品的標定，且可獲得比qPCR更一致的結果。在實際工作中，可以解決沒有陽性對照的情況下的檢測結果準確性問題。
借鑒意義：
 
ddPCR可以不依賴于標準品實現絕對定量，結果可靠，還可以用于不同試劑盒之間的性能比較、驗證。
 
 
參考文獻2：
Patterson B., Morrow C., Singh V., Moosa A., Gqada M.,et.al; Detection of Mycobacterium tuberculosis bacilli in bio-aerosols from untreated TB patients. Version 2. Gates Open Res. 2018. doi: 10.12688/gatesopenres.12758.2.
內容簡述：
 
結核病（TB）主要是空氣傳播的疾病。但是對包含病原菌結核分枝桿菌（Mtb）的生物氣溶膠進行定量和定性分析非常具有挑戰性。本文目的是從新診斷的結核病患者中采樣生物氣溶膠，以檢測和計數結核桿菌。方法：在定制的呼吸氣霧采樣室（RASC）中，在1小時內對35例新診斷出痰陽性的TB患者進行了監測。RASC（1.4m的小型潔凈室）結合了空氣動力學粒徑檢測，實時CO 2監測以及咳嗽聲音記錄。利用微滴式數字PCR（ddPCR）可以檢測每個生物氣溶膠收集裝置中的Mtb。
結論：
 
使用RASC在大多數未經治療的TB患者呼出的生物氣霧劑中鑒定出Mtb。ddPCR檢測比固體培養基上的分枝桿菌培養法更為靈敏。
借鑒意義：
 
在高鐵，車站，飛機等人員密集區進行環境采集樣品如空氣顆粒、水樣的監測，ddPCR有更高的靈敏度。
 
 
參考文獻3：
Persaud, D., Gay, H., Ziemniak, C., Chen, Y. H., Piatak, M., Jr., Chun, T. W., Luzuriaga, K. (2013). Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant. N Engl J Med, 369(19), 1828-1835. doi: 10.1056/NEJMoa1302976
內容簡述：
 
該文是2013年新英格蘭雜志發表的使用Bio-Rad ddPCR對HIV檢測的文獻，主要是對嬰兒在出生后30小時開始接抗逆轉錄病毒治療，并持續監測其體內HIV病毒含量的應用，ddPCR的檢測靈敏度達到LOD <3 拷貝/10⁶ 個細胞。
結論：


ddPCR比熒光定量具有更高的敏感度，可以實現痕量檢測。
借鑒意義：
 
對追蹤到的密切接觸者并接受醫學觀察的疑似人員進行早期篩查時，可考慮使用ddPCR進行核酸檢測，早發現早隔離、早治療防擴散。
 
參考文獻4：
Whale, A. S., Devonshire, A. S., Karlin-Neumann, G., Regan, J., Javier, L., Cowen, S., Huggett, J. F. (2017). International Interlaboratory Digital PCR Study Demonstrating High Reproducibility for the Measurement of a Rare Sequence Variant. Anal Chem, 89(3), 1724-1733. doi: 10.1021/acs.analchem.6b03980
內容簡述：
 
在沒有標準參考物質及無需校準的情況下，北美和歐洲的21個實驗室利用ddPCR針對以KRAS G12D點突變作為檢測靶標，盲測4個不同樣本（最低突變豐度0.17%），其數據結果具有高度的重復性。同時，由于有些熒光定量 PCR儀需要校準且樣品中存在競爭性野生型序列，使用熒光定量PCR來重現性地量化該靶標比較困難。而ddPCR表現出更好的重復性和一致性。
結論：
 
ddPCR可彌補熒光定量PCR在重復性上的不足。
借鑒意義：
 
同一樣本在不同的熒光定量PCR儀、不同試劑盒、不同實驗室檢測的結果也可能出現有差異的情況。通過使用ddPCR, 有助于排查原因，提高疑似患者核酸檢測結果的可靠性及可重復性，可作為復檢的手段。
 
 
參考文獻5：
Tanis C. Dingle.,Ruth Hall Sedlak., Linda Cook., and Keith R. Jerome.(2013). Tolerance of droplet-digital PCR versus real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013 Nov; 59(11): 1670–1672. doi: 10.1373/clinchem.2013.211045
內容簡述：
 
ddPCR由于將反應體系進行微滴分隔處理，對干擾物質如臨床相關的SDS，EDTA和肝素等表現出更高的耐受性。
結論：
 
使用RASC在大多數未經治療的TB患者呼出的生物氣霧劑中鑒定出Mtb。ddPCR檢測比固體培養基上的分枝桿菌培養法更為靈敏。
借鑒意義：
 
不同區、縣采樣后送檢的血液等樣品，提取核酸后可能存在對PCR擴增的抑制因子如肝素等。這些PCR抑制劑的存在，對qPCR檢測結果會有一定干擾，而使用ddPCR, 與qPCR相比具有更強的耐抑制性能。

在新型冠狀病毒疫情防控中，Bio-Rad將與奮戰在抗擊病毒一線的英雄們在一起。我們將春節不休，照常服務，提供技術支持和物料保障。此外，Bio-Rad實時定量PCR擴增儀（注冊證編號：國械注進20193220316）及QX200型數字PCR儀已做好國內庫存準備，隨時待命響應各級防控機構工作需要。