ATCC 17556 熒光假單胞菌的作用機制與應(yīng)用！
 
一、背景
 
熒光假單胞菌屬薄壁菌門假單胞菌科假單胞菌屬，屬于rRNAI群熒光假單胞菌DNA同源組。熒光假單胞菌DNA同源群包括熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌，是一種革蘭陽性桿菌，以不產(chǎn)綠膿素而產(chǎn)熒光素而得名。為環(huán)境污染菌。對人類是少見機會病原菌，可從傷口、痰、胸水、尿和血液中分離出，亦可從血庫血中分離�？稍诒鋬Υ娴难杭把褐破分蟹敝常易匀芎筢尫艃�(nèi)毒素。
 
其內(nèi)毒素的磷脂體部分，可導(dǎo)致不可逆的休克。依據(jù)菌落形態(tài)、色素、生理生化和營養(yǎng)的特性等表型特征將熒光假單胞菌分為5個生物型：I、II、III、IV、G。最早對熒光假單胞菌生防作用的研究是在1978年發(fā)現(xiàn)處理馬鈴薯種塊能增加產(chǎn)量。19世紀(jì)70年代首次提出熒光假單胞菌產(chǎn)生的噬鐵素促進植物生長并抑制植物病害，1986年首次報道克隆得到菌株的抗生素基因。
 
熒光假單胞菌能夠產(chǎn)生10多種抗生性次級代謝產(chǎn)物，在生物防治和生防菌劑的開發(fā)及應(yīng)用方面有巨大的潛力。近年來，隨著分子生物學(xué)的廣泛滲入，通過對這些作用機制的遺傳性狀進行分析，采用遺傳工程加以改良，使得熒光假單胞菌具有更誘人的生防效果。但是，隨著對熒光假單胞菌的深入研究，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌也存在一定的危害培養(yǎng)特征。
 
二、培養(yǎng)特征
 
熒光假單胞菌是典型的革蘭氏陰性菌，電鏡觀察其菌體呈桿狀，對數(shù)生長期時大小一般為（0.7～0.8）μm×（2.3～2.8）μm，呈單個或成對排列，具有極生鞭毛，偶見無鞭毛無動力的菌株，運動活潑，不形成芽孢。DNA的G+C比例范圍為59.4～61.3克分子％，生物型IV有最低值，生物型II有最高值。該菌能液化明膠，葡萄糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵均為陽性，并且能以多種醇類物質(zhì)作為碳源，不能利用乙醇、L－鼠李糖等。甲基紅試驗、檸檬酸鹽發(fā)酵、接觸酶反應(yīng)均為陽性，水解淀粉、脂酶反應(yīng)陰性，對青霉素有抗性，不產(chǎn)生綠膿菌素。
 
具有分解纖維素、蛋白質(zhì)和結(jié)合Fe3+ 的能力，但不能分解幾丁質(zhì)。有些菌株（生物型II，III和IV）能進行反硝化，生物型I和III在卵黃反應(yīng)中為陽性，生物型I一般可分解脂肪，生物型II不解脂。營專性好氧生活，可在pH5.7和7％ NaCl的環(huán)境中生長，最適生長溫度約25～30℃。大多數(shù)菌株在4℃或4℃以下生長，在41℃不生長。
 
熒光假單胞菌在KMB固體培養(yǎng)基上于28℃下培養(yǎng)2d后，生長良好，菌落微隆起，磚紅色，邊緣呈波浪花紋向外擴展，表面較濕潤稍凸起不透明，易用接種針挑起，與該菌屬下其他種類的典型區(qū)別在于能產(chǎn)生水溶性的黃綠色素（青膿素），紫外線（366nm）斜光照射下可見黃綠色熒光。熒光假單胞菌在普通培養(yǎng)基、麥康凱、沙門和志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基平板上均可生長。在PDA培養(yǎng)基上長勢極弱或不生長，菌落深紅色。
 
微生物的良好生長需要培養(yǎng)基各組分濃度和比例合適，碳源和氮源對菌體的生長或蛋白的表達影響較大，濃度太低會造成營養(yǎng)缺乏，限制菌體正常生長，進而影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。國內(nèi)外一些學(xué)者對熒光假單胞菌的最佳生長條件做了研究，對一些促生菌和生防菌的最適培養(yǎng)條件進行了測定和分析，為菌株的最佳發(fā)酵條件和生態(tài)適應(yīng)性評價提供了依據(jù)。
 
三、作用機制及應(yīng)用
 
熒光假單胞菌是一種重要的植物病害生防菌和根際促生菌（PGPR），具有繁殖速度快、適應(yīng)能力強、易于人工培養(yǎng)、制劑穩(wěn)定、施用方便、不污染環(huán)境、防治多種植物病害等優(yōu)點。研究表明，熒光假單胞菌抑制病原菌的菌絲生長、游動孢子囊的產(chǎn)生和游動孢子的萌發(fā)，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)生防菌使病原菌菌絲發(fā)生畸形。
 
生防菌的抑菌圈直徑大，抑菌率高。通過降低病害的發(fā)病程度，能夠提高植物種子的發(fā)芽率和活力指數(shù)，從而保證農(nóng)作物的正常生長。生防菌能在根部定殖，也能通過葉面噴施來防治病害。有學(xué)者不僅在室內(nèi)進行了拮抗性研究，還在田間測試了熒光假單胞菌的防治效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)拮抗效果都非常明顯。該菌的生防機制包括：抗生素作用、噬鐵素對鐵的營養(yǎng)競爭、有效的根際定殖、次生抗性代謝物和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等。
 
1. 抗生素介導(dǎo)的抑制
熒光假單胞菌可通過產(chǎn)生多種抗生素對植物病害的病原物產(chǎn)生抑制。產(chǎn)生抗生素是生防菌抵抗病原菌的重要機制。細(xì)菌通過系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)或者通過抗微生物化合物的合成保護植物。熒光假單胞菌產(chǎn)生的抗生素有1－羧基吩嗪（PCA）、2，4－二乙酰藤黃酚（DAPG）、藤黃綠膿菌素（Plt）、吡咯菌素（Prn）、綠膿菌素（PyOCyAnin）、卵菌素A（OOmyCinA）等。
 
PCA為吩嗪類物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)作為電子載體傳遞電子到靶細(xì)胞，增加胞內(nèi)超氧化物自由基，使靶細(xì)胞中毒死亡；DAPG和Plt為聚酮類抗生素，具有廣譜抗菌活性；Prn屬于氨基糖甘類抗生素，在低濃度時破壞氧化磷酸化的偶聯(lián)機制，而在高濃度時阻止參與呼吸作用的黃素蛋白和細(xì)胞色素C的電子運輸。許多學(xué)者認(rèn)為熒光假單胞菌產(chǎn)生的DAPG是拮抗根部病害的關(guān)鍵因素，DAPG充當(dāng)誘導(dǎo)其本身的生物合成基因的表達信號的化合物。這些抗生素通常在很低濃度下就可阻礙病原微生物的生長。
 
2. 噬鐵素介導(dǎo)的抑制
熒光噬鐵素是由熒光假單胞菌產(chǎn)生的胞外水溶性黃綠色素，是其特有的鐵載體，可以螯合環(huán)境中微量的鐵元素。其作用機制是通過配合基的螯合反應(yīng)，形成鐵－噬鐵素螯合物，從而增加土壤中的生物有效性，并通過特異的轉(zhuǎn)動系統(tǒng)將鐵轉(zhuǎn)移到體內(nèi)，不僅可以滿足自身的生長需要，還可以使環(huán)境中的鐵濃度進一步降低，抑制病原微生物的生長繁殖，進而達到控制植物病害的目的。
 
3. 根部定殖
熒光假單胞菌只有成功地在根際定殖后，其抑制機制才能真正起作用。熒光假單胞菌能在幼根表面形成一層均勻的保護層；而沒有防病作用的菌株不產(chǎn)生保護層，說明熒光假單胞菌在根部定殖時保護了病原菌的侵染位點，降低侵染機會，是防病的關(guān)鍵因素之一。不同的熒光假單胞菌在不同的根際有不同的定殖能力。定殖能力的強弱也與土壤類型相關(guān)的間接因素如濕度、溫度、PＨ 值等有關(guān)。
 
4. 次生抗性代謝物
熒光假單胞菌產(chǎn)生許多具有抗性的次生代謝物，對植物病原菌具有拮抗作用。如一些熒光假單胞菌產(chǎn)生的HCN能影響植物的病原菌。熒光假單胞菌還能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、溶菌酶、木聚糖酶和胞外殼聚糖酶等對物質(zhì)進行降解，在給植物提供營養(yǎng)的同時還可減少植物病害的發(fā)生。
 
5. 誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性
某些植物如煙草、黃瓜、擬南芥等對病毒、細(xì)菌和真菌葉部病原的誘導(dǎo)抗性可能是由于一些熒光假單胞菌在根部的定殖而產(chǎn)生。其可能的作用機制是產(chǎn)生抗微生物的低分子量化學(xué)物質(zhì)，如植物保護素、雙萜、多聚物、木質(zhì)素和糖蛋白，誘導(dǎo)一些水解酶和氧化酶類。水楊酸、脂多糖、噬鐵素是重要的誘導(dǎo)物質(zhì)。植物種類、植物病害以及植物生長環(huán)境的不同，熒光假單胞菌抑制病原菌的機理有所不同。
 
研究表明，熒光假單胞菌產(chǎn)生的抗生素可以改變病原菌細(xì)胞的通透性，降低細(xì)胞的表面張力，從而使細(xì)胞破裂死亡。研究表明，熒光假單胞菌產(chǎn)生的噬鐵素螯合了鐵元素，降低了環(huán)境中的鐵元素的濃度，從而讓病原菌不能很好地生長，達到抑制病害的目的。
 
目前，國內(nèi)外學(xué)者通過基因手段檢測次生代謝產(chǎn)物對植物病害防治的研究較多。許多學(xué)者通過基因手段，將合成次生代謝產(chǎn)物的基因突變，發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的缺失突變株無防病功能或防病能力明顯下降，純化后的次生代謝產(chǎn)物通過誘導(dǎo)局部和系統(tǒng)抗病性而發(fā)揮防病作用。研究了如何利用GACA/GACS系統(tǒng)檢測遺傳穩(wěn)定性好的優(yōu)良菌株VUPf5產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物防止小麥上的病害。通過對VUPf5的GACA基因和GACS基因進行突變，然后與具野生型基因的菌株對比，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的效率顯著降低。
 
四、風(fēng)險
 
熒光假單胞菌除了可以防治植物的病害之外，本身還是一種環(huán)境污染菌。在日常生活中，熒光假單胞菌是奶類、蛋類在低溫保存條件下導(dǎo)致腐敗變質(zhì)的主要細(xì)菌之一。熒光假單胞菌對于人類是一種罕見的機會致病菌。在臨床上最多見的是血液及血制品被熒光假單胞菌污染，當(dāng)病人輸入了被熒光假單胞菌污染的血液及血制品后，可出現(xiàn)敗血癥、感染性休克和血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重后果。
 
由于現(xiàn)有的許多抗生素對熒光假單胞菌都不敏感，所以一旦感染此菌，病死率很高。熒光假單胞菌還可以使一些動物體發(fā)生病變，產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀。在植物體中，熒光假單胞菌可以協(xié)同一些病蟲害加重對植物體的危害，如研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲在結(jié)合有毒的熒光假單胞菌時，能夠促進黑松的致病率。熒光假單胞菌對動植物的危害受到外部環(huán)境的影響，越有利于熒光假單胞菌生長的環(huán)境就對動植物的危害越大。
 
隨著接種冰核細(xì)菌的濃度增加，煙株的凍害程度逐漸加劇。假單胞菌屬中除了熒光假單胞菌之外，其他的假單胞菌也能造成環(huán)境的污染。研究發(fā)現(xiàn)寧波沿海陸源排污口中存在較多的假單胞菌屬，假單胞菌屬的含量與排污口的主要污染物有關(guān)，氨氮含量較高的排污口假單胞菌屬的含量更高。還推測與季節(jié)性溫度變化有關(guān)。
 
五、分離篩選
 
目前，通常采用平板稀釋法分離篩選熒光假單胞菌。分離篩選的指標(biāo)包括熒光假單胞菌的體外病原體抑制、生物表面活性劑的生產(chǎn)、磷酸鹽的溶解能力和參與抗生素合成的基因等方面，從而得到生防能力較強的菌株。對分離篩選得到的菌株經(jīng)過形態(tài)、生理生化試驗以及16ＳrRNA基因序列分析，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》就可鑒定此類生防菌為熒光假單胞菌。近些年，研究者從不同植物根際對熒光假單胞菌進行了分離篩選，獲得了一些有應(yīng)用潛力的菌株：
 
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