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肝癌類器官培養(yǎng)基是一種為促進(jìn)肝癌類器官體外形成和擴(kuò)增而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。它是一種無菌的液體混合系統(tǒng),含有必需和非必需的氨基酸、維生素、有機(jī)和無機(jī)化合物、激素、生長(zhǎng)因子、微量礦物質(zhì)等。該培養(yǎng)基的獨(dú)特配方可以提供一個(gè)合適的細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)環(huán)境,選擇性地促進(jìn)體外人肝癌類器官的生長(zhǎng)。
1. 肝癌類器官培養(yǎng)
將消化好的肝癌細(xì)胞懸液計(jì)數(shù),按照1-2萬細(xì)胞每孔計(jì)算所需的細(xì)胞數(shù),根據(jù)計(jì)算好的體積吸取細(xì)胞懸液加入預(yù)冷的1.5 mL離心管中,補(bǔ)齊預(yù)冷的DF12至所需體積,將預(yù)冷后的細(xì)胞懸液加入等體積的Matrigel基質(zhì)膠(Corning)中輕輕混勻(全程冰上操作),然后將細(xì)胞與基質(zhì)膠的混合液按照40 μL/孔接種于24孔板。將接種好的培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱至少30 min,待Matrigel完全凝固,然后沿24孔壁每孔緩慢加入500 μL預(yù)先恢復(fù)至室溫的類器官培養(yǎng)基,3天后鏡下觀察類器官形成情況,粒徑大于50 μm即認(rèn)為類器官已經(jīng)形成,每5天更換一次培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),持續(xù)觀察類器官大小,鏡下觀察大部分類器官大小均大于50 μm且大小不再增大即可收集類器官進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2. 肝癌類器官收集
棄培養(yǎng)基,每孔加入500 μL預(yù)冷DF12,反復(fù)吹打至基質(zhì)膠完全脫離板底,收集至15 mL離心管中,1500 rpm離心5 min,輕輕吸去上清和基質(zhì)膠層,待用。
3. 肝癌類器官傳代
收集的類器官,加入3-5 mL類器官解離試劑(PRS-ODR),37℃,200 rpm水平搖床振蕩消化(具體時(shí)間根據(jù)類器官大小和數(shù)量決定,以肉眼可見顆粒明顯減小一半為準(zhǔn),可中間取消化的類器官顯微鏡觀察,類器官消化至包含有3~10個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊最佳);消化完全后采用等體積的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。1500 rpm離心3 min,棄上清,使用清洗液重懸沉淀后1500 rpm再次離心3 min;加入預(yù)冷的胃癌類器官培養(yǎng)基進(jìn)行重懸,計(jì)數(shù),按照培養(yǎng)步驟操作繼續(xù)培養(yǎng)。