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食管癌條件重編程培養(yǎng)基是一種為促進(jìn)食管鱗癌原代細(xì)胞體外生長而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。它是一種無菌的液體混合系統(tǒng),含有必需和非必需的氨基酸、維生素、有機(jī)和無機(jī)化合物、激素、生長因子、微量礦物質(zhì)等。該培養(yǎng)基產(chǎn)品基于碳酸氫鹽的緩沖體系,在5% CO2/95%空氣的培養(yǎng)箱中平衡時,pH值為7.4。該培養(yǎng)基的配方可以提供一個合適的平衡營養(yǎng)環(huán)境,選擇性地促進(jìn)體外人食管鱗癌原代細(xì)胞的生長。
4℃避光保存3個月內(nèi)有效。
1. 食管癌原代細(xì)胞培養(yǎng)
初次分離的食管癌小樣本細(xì)胞懸液一般無需計(jì)數(shù),直接種入12孔板中;食管癌術(shù)中樣本過70微米篩網(wǎng)后計(jì)數(shù),按照說明書表1中細(xì)胞數(shù)接種在合適的培養(yǎng)器皿中,加入γ射線輻照后的NIH-3T3細(xì)胞(添加滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量見說明書如表1和表2所示),原代細(xì)胞初次接種后2-3 天勿動(利于細(xì)胞貼壁),培養(yǎng)過程中若培養(yǎng)基顏色變黃但細(xì)胞未長滿時可換半液,鏡下觀察細(xì)胞未長滿但NIH-3T3細(xì)胞已不足時,適量補(bǔ)充γ射線輻照后的NIH-3T3細(xì)胞(一般補(bǔ)加初始數(shù)目的一半)。
2. 食管癌原代細(xì)胞傳代
鏡下觀察細(xì)胞形成克隆,且匯合度80~90%時即可傳代;培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞,棄舊培養(yǎng)液,0.25%胰酶洗滌30秒后吸盡,再加入適量0.05%胰酶,37℃孵育,5 min后拿出輕拍培養(yǎng)瓶/板側(cè)面,顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況;細(xì)胞消化至細(xì)胞變圓并開始脫落時用終止培養(yǎng)基終止消化,并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中,1500 rpm離心3 min;棄上清,以1-2 mL相對應(yīng)的原代細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,活細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞懸液按適合的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶/板,加入γ射線輻照后的NIH-3T3細(xì)胞(不同規(guī)格培養(yǎng)瓶/板底面積、接種原代細(xì)胞數(shù)量、添加滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量見說明書表1所示),補(bǔ)加原代細(xì)胞培養(yǎng)基至所需體積,輕輕搖晃混勻,表面消毒后置培養(yǎng)箱,37 ℃ 、5 % CO2條件培養(yǎng)。其他步驟同上。