【貨號和規格】T115-01，20 rxn
【產品概述】
    隨機突變是闡述蛋白質結構和功能之間的關系、改進蛋白質性能的重要工具。StarMut隨機突變試劑盒基于易錯PCR (error-prone PCR) 技術，利用Taq DNA polymerase不具有3′→5′校對功能的特性，在特定的反應緩沖體系中，向擴增的目的基因中引入隨機突變密碼子。帶有隨機突變的擴增產物通過雙酶切，連接到表達載體中構建文庫，然后轉化入表達宿主中，進行蛋白活性篩選。如果經一次突變反應不能獲得滿意的結果，可采用連續易錯PCR (sequential error-prone PCR)策略，即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續反復地進行隨機誘變，使每一次獲得的突變累積而產生更有意義的突變。
    本試劑盒包含有優化的2 x StarMut Random System、StarMut Enhancer和ddH2O三種組分，使用時只需加入適量的DNA模板和合成的兩條擴增引物，并用水補足體積，即可進行擴增反應，操作簡便快速，大大減少了多次加樣可能造成的出錯和污染機會。2 x StarMut Random System含有優化濃度的Taq DNA polymerase、dNTPs、反應緩沖液和穩定劑，可最大限度地克服常規易錯PCR 技術中，由于Taq DNA polymerase本身的偏愛性造成的以GC突變為主的缺點，獲得相對均衡的突變譜。堿基突變率可通過適量添加StarMut Enhancer、調整模板DNA量和改變PCR擴增循環數進行控制。
    下表列出以10 ng質粒DNA為模板，PCR擴增一條1 kb DNA片段(20個循環)后測序檢測得到的突變率結果。需要注意的是，由于不同DNA模板的堿基組成不同、長度不一，以及不同引物的擴增效率存在差異，所以即使在相同的PCR反應條件下，兩組PCR產物所得到的突變率也可能不同。因此我們建議根據實驗的具體要求，首先進行多個小體系(20 μl)擴增預實驗，分別加入不同體積的StarMut Enhancer(如0 μl、1μl、5 μl、10 μl等)，摸索出符合目標突變率的反應條件后，再放大擴增體系。其他影響突變率的因素見【注意事項】。

【產品組分】
2 x StarMut Random System
0.5 ml
StarMut Enhancer
0.1 ml
ddH2O
1 ml
 
 
【保存條件】
−20℃保存，有效期一年；經常使用，可于4℃保存，有效期三個月。
【使用方法】
1．引物設計原則：
(1)   正、反向擴增引物各一條，長度約20~45個堿基，3’端分別與目標突變DNA片段的上下游結合；
(2)   盡量將引物的GC含量控制在40~60%；
(3)   引物如帶有克隆酶切位點，必須添加足夠的保護堿基以確保酶切效率；實驗證明，引物結合在目標DNA片段的酶切位點外側可提高酶切效率，增加轉化的克隆數量。
2．隨機突變反應：

(1)   PCR反應體系：
向PCR薄壁管中依次加入下列試劑
質粒DNA模板(1~10 ng/μl) *        1 μl
2 x StarMut Random System       25 μl
正向擴增引物 (10 μM)                   1 μl
反向擴增引物 (10 μM)                   1 μl
StarMut Enhancer                          0~20 μl
ddH2O 補足體積至                50 μl
(2)   混勻后短暫離心，放入PCR儀。
(3)   PCR循環參數的設置：
95℃       2 min
94℃       30 sec
50~65℃      1 min              x 16~25 cycles*
72℃       1 min/1 kb
72℃       7 min

*突變率可通過改變起始模板濃度和擴增循環數進行控制。起始模板濃度越高，突變率越低；擴增循環數越高，突變率越高。
 
 
3．取1~5 μl PCR產物電泳檢測條帶濃度和特異性。
4．剩余的PCR產物電泳，切膠回收目標DNA片段。
5．酶切、連接、轉化到表達宿主菌株中進行篩選。
【注意事項】
1．                 由于不同DNA模板的堿基組成不同、長度不一，以及不同引物的擴增效率存在差異，所以即使在相同的PCR反應條件下，兩組PCR產物所得到的突變率也可能不同。因此我們建議根據具體實驗要求，首先進行多個小體系（20 μl）擴增預實驗，分別加入不同體積的StarMut Enhancer（如0 μl、1 μl、5 μl、10 μl等），通過測序或活性檢測等方法，摸索出符合目標突變率的反應條件后，再放大擴增體系。
2．                 起始DNA模板的濃度對突變率有很大影響，通常可通過提高或降低DNA模板的濃度來調整突變率。鑒于不同型號的分光光度計檢測的DNA濃度存在偏差，DNA模板最好在酶切線性化后，采用凝膠電泳方法，與已知濃度的線性化雙鏈DNA或商品化的DNA marker進行對比，確定其濃度。
3．                 突變反應產物必須進行切膠回收處理，去除DNA模板、PCR產物上結合的Taq酶以及其他雜質。常規的乙醇沉淀、硅膠膜（珠）或玻璃奶吸附等方法，均無法去除結合的Taq酶，后者可能遮蔽酶切位點，影響克隆效率。
4．                 建立隨機突變文庫通常需要10~200 ng/μl （相當于500 ng ~10 μg/50 μl體系）的PCR產物。如遇產量不足，可通過下列方法提高產量：
(1) 突變率符合需求時，可放大PCR體系，或切膠回收PCR產物后，采用常規PCR反應條件進行擴增；
(2) 突變率低于需求時，提高PCR擴增循環數，或切膠回收PCR產物后，進行第二輪隨機突變反應；
(3) 重新設計擴增引物;
(4) 降低退火溫度；
(5) 確保模板質量，采用凝膠電泳方法精確定量。
5．                 對于帶有克隆酶切位點的DNA模板，必須在PCR反應結束后，使用DpnI完全消化清除甲基化的模板，再切膠回收目標DNA片段。對于非甲基化的質粒（例如從大腸桿菌JM110或SCS110菌株中提取的質粒），可通過轉化dam＋的大腸桿菌菌株（如DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue等），再抽提獲得甲基化的質粒作為PCR反應模板。
6．                 經過雙酶切的克隆載體在插入突變DNA片段前，應首先通過自身連接檢測，確保極低的自連背景。必要時可采用去磷酸化、切膠回收等方法把自連率降至最低，以免影響后續連接反應。
【備注】
本產品僅供科研使用。在確認產品質量出現問題時，本公司承諾為客戶免費更換等量的質量合格產品。在所有情況下，本公司對此產品所承擔的責任僅限于此產品的價值本身。