‍蛋白質(zhì)組學(xué)介紹

        蛋白質(zhì)組（Proteome）是指基因組表達(dá)的所有相應(yīng)蛋白質(zhì)的集合，即細(xì)胞、組織或機體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是指利用高分辨的蛋白質(zhì)分離技術(shù)和高效的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上整體性、動態(tài)和定量地研究生命現(xiàn)象及規(guī)律的科學(xué)，是系統(tǒng)生物學(xué)的有機組成部分。

   
        蛋白質(zhì)組是空間和時間上動態(tài)變化著的整體，一個基因組對應(yīng)多個蛋白質(zhì)組。相比穩(wěn)定的基因組，蛋白質(zhì)組是遺傳信息、環(huán)境因素、生活習(xí)慣等多因素的綜合體現(xiàn)。同一細(xì)胞/組織，在不同時間/不同環(huán)境條件下蛋白譜的表達(dá)也存在不同。如上圖所示：線粒體呼吸鏈酶家族的蛋白表達(dá)水平不僅在不同成人器官中存在顯著差異，同樣在心臟中，胎兒與成人蛋白表達(dá)量也差異巨大。因此，蛋白質(zhì)組能實時反映細(xì)胞/組織功能和疾病發(fā)生狀態(tài)的一類分子，也是疾病發(fā)生較為相關(guān)的分子類型，具有廣闊研究前景。

 

蛋白質(zhì)組學(xué)定性原理

  
        隨著高效液相分離技術(shù)（HPLC）和靜電場軌道阱（Orbitrap）質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主要技術(shù)。其鑒定蛋白質(zhì)的基本步驟（bottom-up）一般如右圖所示：收集樣本后進行總蛋白質(zhì)提取→消化切割蛋白為多肽片段→HPLC分離→分級進入MS電場進一步離子化→MS獲得各離子質(zhì)荷比和峰型信息→軟件計算氨基酸組成→數(shù)據(jù)庫檢索比對獲得蛋白質(zhì)的定性和序列信息。

 

蛋白質(zhì)組學(xué)定量原理

        基于LC-MS/MS技術(shù)的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)一般分為標(biāo)記法和非標(biāo)記法兩種類型。目前常用的標(biāo)記法有：iTRAQ（體外）、TMT（體外）、SILAC（體內(nèi)）三種基于同位素標(biāo)簽進行半定量的方法。以常用的iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)定量為例（如下圖）：iTRAQ是由8種（113/114/115/116/117/118/119/121）同位素標(biāo)簽組成，在實驗過程中將8例不同樣品分別酶解成多肽片段→分別標(biāo)記8種同位素標(biāo)簽→將8例標(biāo)記好的多肽樣品混合成1例總樣品→進入LC-MS/MS分析系統(tǒng)→二級MS階段iTRAQ平衡基團發(fā)生中性丟失，在低質(zhì)量區(qū)產(chǎn)生多個報告離子→計算各報告離子峰面積，獲得同一肽段不同樣品間的相對豐度差異比值→加權(quán)計算肽段豐度獲得總蛋白質(zhì)相對定量值。

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        以iTRAQ技術(shù)為代表的體外標(biāo)記技術(shù)是目前應(yīng)用廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)半定量檢測技術(shù)，其操作簡單，數(shù)據(jù)穩(wěn)定性高。然而，受到同位素標(biāo)簽數(shù)量的限制，在進行大批樣品實驗時，以Label Free和DIA為代表的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)則具有更多優(yōu)勢，詳細(xì)信息見子網(wǎng)頁。

 

華盈生物蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)

蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺

經(jīng)典文獻(xiàn)賞析‍

‍如何利用TMT技術(shù)實現(xiàn)多樣品蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析

        2017年5月美國學(xué)者Pamir N等運用TMT標(biāo)記技術(shù)成功完成了20例小鼠脂肪組織蛋白質(zhì)組定量比較。相關(guān)研究工作發(fā)表在蛋白質(zhì)組學(xué)代表性雜志《Molecular & Cellular Proteomics》上（PMID: 28325852）。該研究實驗設(shè)計巧妙，突破了iTRAQ和TMT等體外標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù)在同位素標(biāo)簽數(shù)量上的限制。
 

• TMT蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究實驗設(shè)計

        研究人員將8周齡的20只小鼠處理分成四組（每組5只小鼠）：分別低脂喂養(yǎng)8周和18周，高脂喂養(yǎng)8周和18周。分別取各小鼠附睪脂肪組織進行3組TMT蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，共計20例樣品。將3組質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過pool樣內(nèi)標(biāo)進行校準(zhǔn)獲得可比性，而后進行組間蛋白譜比較，獲得衰老（aging）和高脂飲食（HF）調(diào)控的脂肪組織特征蛋白譜，重新認(rèn)識衰老與高脂飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，具體實驗設(shè)計，見圖1。
 

                                                    圖1 多樣本TMT蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)路線
 

• ‍高脂飲食易造成代謝紊亂‍

        經(jīng)過18個月高脂飲食喂養(yǎng)，小鼠出現(xiàn)了代謝狀態(tài)系統(tǒng)性紊亂，隨時間增長逐漸加劇。在低脂狀態(tài)下，衰老是引起代謝紊亂主要因素，但紊亂程度較高脂環(huán)境要輕，見圖2。
 

                                                         圖2 高脂飲食和衰老造成糖脂代謝紊亂
 

• 蛋白質(zhì)組改變伴隨代謝紊亂發(fā)生‍‍

       
        通過對比分析組間定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的差異，研究人員發(fā)現(xiàn)衰老是引起蛋白質(zhì)組變化的重要因素。而在高脂環(huán)境下，衰老對于蛋白質(zhì)組的調(diào)變影響將被放大，表現(xiàn)為代謝相關(guān)差異蛋白顯著增多。
 

                                                  圖3 高脂飲食和衰老造成蛋白質(zhì)組顯著調(diào)變
 

 
        通過對差異蛋白譜進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析和GO功能分析，進一步明確了，衰老因素主要通過調(diào)控脂代謝、氨基酸代謝相關(guān)蛋白群改變引發(fā)代謝紊亂。而在高脂環(huán)境下，衰老對免疫系統(tǒng)、補體激活、基質(zhì)重塑等蛋白群又產(chǎn)生了新的影響，造成了更嚴(yán)重的代謝紊亂發(fā)生，見如圖4。
 

                                                        圖4 差異蛋白譜互作網(wǎng)絡(luò)分析
 

 
        小結(jié)：通過本文可以看出，蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有很大的發(fā)展空間，可以填補很多研究知識上的空白。良好的實驗設(shè)計可以突破技術(shù)限制，并讓實驗數(shù)據(jù)具有更強的說服力。
 

        華盈生物致力于從實驗設(shè)計 → 實驗執(zhí)行 → 數(shù)據(jù)分析，提供一系列高標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)，為行走在科研道路上的科學(xué)家增添動力。

 

參考文獻(xiàn)

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