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GENMED組織IKKβ激酶活性光譜法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
GENMED組織IKKβ激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過人工合成多肽底物，在IKKβ激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，受到IKKβ磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中IKKβ特異活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中IKKβ激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。
技術(shù)背景
B細(xì)胞κ輕鏈多肽基因促動子抑制劑激酶復(fù)合物（Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells，kinase complex；IκB kinase；IKK；EC 2.7.11.10），是NF-κB信號通路中的成員之一，由3個亞體構(gòu)成：IKKα，又稱為IKK1或CHUK（conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase）；IKKβ，又稱為IKK2或IKBKB；IKKγ，又稱為NEMO或IKBKG。ITI1、GPRK2L、GPRK4，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬中鳥苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體激酶（guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase；GRK）亞系成員之一。多基因GRK亞系由6個成員構(gòu)成，分成3類：包括GRK1（視網(wǎng)膜色素激酶家系；rhodopsin kinase）、GRK2/3（β腎上腺素能受體激酶；β-adrenergic receptor kinase）以及IKK/5/6（IKK激酶）。其中G蛋白偶聯(lián)受體激酶4至少有4種變異體：IKKα、β、γ、δ，在睪丸組織中高度表達(dá)。IKK使G蛋白偶聯(lián)受體，例如多巴胺等去敏化（desensitization）、以及精子授精等有關(guān)。其目標(biāo)蛋白為活化的G-蛋白偶聯(lián)受體蛋白，進(jìn)行磷酸化后，抑制其功能。其功能異常將導(dǎo)致遺傳性或獲得性高血壓等疾病。其磷酸化目標(biāo)序列為RRREEEEESAAA。基于底物RRREEEEESAAA，在IKKβ激酶敏感性抑制劑5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺（(5-phenyl-3-ureido)-thiophene-2-carboxamide）存在與否的情況下，受到IKKβ激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析IKKβ的特異活性。其反應(yīng)方式為：
產(chǎn)品內(nèi)容
GENMED清理液（Reagent A） 毫升
GENMED裂解液（Reagent B） 毫升
GENMED緩沖液（Reagent C） 毫升
GENMED酶促液（Reagent D） 微升
GENMED反應(yīng)液（Reagent E） 微升
GENMED底物液（Reagent F） 微升
GENMED陰性液（Reagent G） 微升
GENMED專性液（Reagent H） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存GENMED清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
用戶自備
IKKβ激酶：用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
（微型）臺式離心機(jī)：用于組織預(yù)處理
比色皿或酶標(biāo)板：用于光譜分析操作的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析
實(shí)驗(yàn)步驟
- 待測樣品準(zhǔn)備
- 手術(shù)取出動物組織，并秤重500毫克組織重量
- （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A）清洗
- （選擇步驟）抽去清理液
- 移入到一個液氮凍存管
- 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
- 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
- 加入置于冰槽里的xx微升GENMED裂解液（Reagent B）
- 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/em>）
- 即刻放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
- 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
- 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
- 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
- 測定準(zhǔn)備
- 準(zhǔn)備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里
- 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
- GENMED緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
- 背景對照測定
- 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）
- 加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
- 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent G）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘
- 樣品總活性測定
- 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）
- 加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
- 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入5微升待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘
- 樣品非特異活性測定
檢測開始前，移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升GENMED專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。
- 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）
- 加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
- 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘
- 計算樣品活性
- 樣品總活性和非特異活性計算
2）樣品特異活性計算
七、酶標(biāo)板測定
1）樣品總活性測定
- 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
- 分別移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到96孔板中
- 分別加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
- 分別加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）
- 分別加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
- 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
- 在30℃溫度下孵育3分鐘
- 分別加入xx微升GENMED陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克組織裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
- 輕輕搖動酶標(biāo)板
- 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
- 活性計算：
- 樣品非特異活性測定
檢測開始前，移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升GENMED專性液（Reagent H）和待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。
- 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測樣品
- 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到96孔板中
- 加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）
- 加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
- 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
- 在30℃溫度下孵育3分鐘
- 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
- 輕輕搖動酶標(biāo)板
- 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
- 活性計算：
- 樣品特異活性計算
八、抑制劑篩選
- 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品
- 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理
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內(nèi)容物 |
空背景對照 |
樣本背景 |
完全酶活性 |
待測抑制劑酶活性 |
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GENMED緩沖液（Reagent C） |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
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GENMED陰性液（Reagent G） |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
—— |
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待測抑制劑 |
—— |
xx微升 |
―― |
xx微升 |
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用戶自備的純化酶 |
—— |
—— |
xx微升（1毫單位） |
xx微升（1毫單位） |
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96孔板每孔總量 |
空背景對照孔 （xx微升） |
樣本背景孔 （xx微升） |
完全活性孔 （xx微升） |
待測抑制劑樣品孔 （xx微升） |
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輕輕搖動酶標(biāo)板，混勻，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作 |
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- 分別移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
- 分別加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
- 分別加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）
- 分別加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
- 輕輕搖動酶標(biāo)板
- 在30℃溫度下孵育3分鐘
- 加入20微升上述預(yù)處理的待測樣品
- 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測：測讀30分鐘
- 抑制活性計算：
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作
- 操作時，須戴手套
- 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
- 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
- 樣品須澄清，至關(guān)重要
- 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測定
- 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘
- 光譜測定后，比色皿須清洗徹底
- 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
- 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
- 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
- 可以使用IKKβ抑制劑作為抑制劑對照或陰性對照
- IKKβ活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
使用承諾
杰美基因秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。
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編號 名稱 規(guī)格
GMS50162.4.3 GENMED組織IKKβ激酶活性光譜法定量檢測試劑盒 20次
GMS50162.4.3A GENMED清理液（Reagent A） 毫升
GMS50162.4.3B GENMED裂解液（Reagent B） 毫升
GMS50162.4.3C GENMED緩沖液（Reagent C） 毫升
GMS50162.4.3D GENMED酶促液（Reagent D） 毫升
GMS50162.4.3E GENMED反應(yīng)液（Reagent E） 毫升
GMS50162.4.3F GENMED底物液（Reagent F） 毫升
GMS50162.4.3G GENMED陰性液（Reagent G） 毫升
GMS50162.4.3H GENMED專性液（Reagent H） 毫升
試劑盒訂購信息
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產(chǎn)品編號 |
名稱 |
規(guī)格 |
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GMS50162.1 |
細(xì)胞IKKα激酶活性光譜法定量檢測試劑盒 |
20次 |
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GMS50162.2 |
組織IKKα激酶活性光譜法定量檢測試劑盒 |
20次 |
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GMS50162.3 |
細(xì)胞IKKβ激酶活性光譜法定量檢測試劑盒 |
20次 |
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GMS50162.4 |
組織IKKβ激酶活性光譜法定量檢測試劑盒 |
20次 |
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