YIJI線粒體呼吸鏈復(fù)合物V活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI線粒體呼吸鏈復(fù)合物V（F0F1-ATP酶/ATP合成酶）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定與ATP合成對(duì)應(yīng)的ATP水解產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測(cè)定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動(dòng)物、人體、酵母）以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣品的F0F1-ATP酶/ATP合成酶的特異性活性檢測(cè)。可用于心肌、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

線粒體呼吸鏈復(fù)合物V，通常稱為ATP合成酶（ATP synthase）、F型ATP酶（F type ATPase）和F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase），是線粒體氧化磷酸化的終極反應(yīng)。其分子量為500KD，含有十六個(gè)亞單位，其中兩個(gè)：ATP酶6和8為線粒體DNA編碼的。ATP酶主要有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：F0為質(zhì)子通道，由幾個(gè)膜蛋白構(gòu)成，包括a、b、c、d、e、F6、A6L、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和F1催化活性結(jié)構(gòu)域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構(gòu)成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。復(fù)合物V的主要功能在于產(chǎn)生大部分細(xì)胞所需的能量ATP。ATP的合成需要線粒體內(nèi)膜電子傳遞到氧分子時(shí)，呼吸鏈蛋白所產(chǎn)生的質(zhì)子梯度變化。質(zhì)子通過F0結(jié)構(gòu)域傳遞到基質(zhì)，激活F1催化活性結(jié)構(gòu)域，促使ATP合成。該酶異常會(huì)導(dǎo)致心肌和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。基于ATP，在寡霉素參與下，受到F1F0 ATP酶的水解，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析F1F0 ATP酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

F1F0 ATPase

 ATP   =    ADP  +  Pi

 

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

         

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

  （高吸收峰） （低吸收峰）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI緩沖液（Reagent A）  20毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent B）      2.5毫升

YIJI陰性液（Reagent C）     2毫升

YIJI底物液（Reagent D） 500微升

YIJI專性液（Reagent E）   250微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI反應(yīng)液（Reagent B），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI反應(yīng)液（Reagent B）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔30秒，讀數(shù)11次（共5分鐘），并置零
• YIJI緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取780微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入100微升YIJI陰性液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘

 

• 樣品總活性測(cè)定

 

• 移取780微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入100微升待測(cè)樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘

 

• 樣品非特異活性測(cè)定

 

實(shí)驗(yàn)開始前，移取100微升待測(cè)樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）到1.5毫升離心管，加入20微升YIJI專性液（Reagent E），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

 

• 移取760微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升YIJI反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI底物液（Reagent D）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
• 加入120微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)1分鐘或5分鐘

 

• 計(jì)算樣品活性

 

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

 

【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) X 1或5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

2）樣品特異活性

 

樣品總活性測(cè)定－樣品非特異活性測(cè)定＝樣品特異活性

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為21次操作（10個(gè)樣本），包括1次背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
• 線粒體樣品檢測(cè)前，建議凍存融解（－70℃至37℃）循環(huán)3次
• 如果增強(qiáng)酶活檢測(cè)，建議使用YIJI線粒體復(fù)合物待測(cè)樣品預(yù)處理試劑盒－YJ10342
• 建議線粒體懸液使用0.25 M SUCROSE和2 mM EDTA，pH9.0；忌用磷酸緩沖溶液
• 建議使用線粒體裂解懸液，而不是細(xì)胞裂解懸液。如果使用細(xì)胞裂解懸液，第一須澄清；第二須加50微克
• 加入樣品后3秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定
• 反應(yīng)1分鐘后光譜測(cè)定值趨于穩(wěn)定；測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可以持續(xù)5分鐘
• 測(cè)定值由高到低變化，即0分鐘測(cè)定讀數(shù)高于1分鐘或5分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
• 光譜測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測(cè)樣本線粒體蛋白濃度為10微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供YIJI線粒體溶解試劑盒YJ10018為后續(xù)的線粒體蛋白濃度測(cè)定的預(yù)處理試劑盒和YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒YJ30030.1）
• 樣品特異活性是指寡霉素敏感的ATP合成酶，去除其它干擾因素（例如復(fù)合物I/II/III/IV等）
• 線粒體呼吸鏈復(fù)合物V酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列線粒體及其酶類技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確