YIJI植物氫ATP酶（H －ATPase）總活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒

           產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI植物氫ATP酶（H＋-ATPase）總活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用氫ATP酶、丙

酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，在排除其它ATP酶干擾的情況下，受到氫ATP酶的水解產(chǎn)生的

ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測定其氧化后吸

光峰值（NADH濃度）的變化，以此進(jìn)行測算單位酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、

成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、

上胚軸（epicotyl）等H＋-ATP酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡

捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

氫ATP酶（H＋-ATPase；EC3.6.3.6），又稱為質(zhì)子或氫離子轉(zhuǎn)位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生

物能量傳導(dǎo)過程中起著重要作用。其分成三類：質(zhì)膜型（plasma membrane type或P型） 真細(xì)菌型、（eubacterial

type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。質(zhì)膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的質(zhì)膜上，約

100kd蛋白；真細(xì)菌型存在于葉綠體、線粒體和細(xì)菌上，由疏水的膜部分和親水的催化部分組成；囊/液泡

型存在于真核生物細(xì)胞器的囊泡系統(tǒng)。其中植物質(zhì)膜氫ATP酶，100kd分子量，是植物細(xì)胞膜上重要的功能

酶，為植物生命活動的主要酶之一。液泡型氫ATP酶是V型ATP酶的主要成員，400 至 600kd，含有胞漿復(fù)

合體（V1）和胞膜復(fù)合體（V0），通過產(chǎn)生電子泵，轉(zhuǎn)移質(zhì)子，是微粒體和溶酶體酸性化，同時提供次級

活性轉(zhuǎn)運體的動力。氫ATP酶催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。這一去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，

成為細(xì)胞生命代謝的能源。同時利用細(xì)胞內(nèi)ATP釋放的能量逆向跨質(zhì)膜把質(zhì)子轉(zhuǎn)運出細(xì)胞，產(chǎn)生并保持細(xì)

胞膜或細(xì)胞器兩側(cè)氫離子的電化學(xué)梯度，為一系列次級轉(zhuǎn)運體和通道蛋白對各種營養(yǎng)物質(zhì)及離子的跨質(zhì)膜

轉(zhuǎn)運提供能量。植物氫ATP酶還參與細(xì)胞內(nèi)pH水平、細(xì)胞伸長、氣孔開閉、以及植物對環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)等

多種生理過程的調(diào)節(jié)。基于底物ATP，在排除其它，包括鈣（EGTA處理）、鈉鉀（烏本苷；ouabain處理）

和氫鉀（奧美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干擾下，受到氫ATP酶的水解，進(jìn)而通過丙酮酸激酶（pyruvate

kinase； 和乳酸脫氫酶PK）（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced

nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine

dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析氫ATP酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

H＋-ATPase

ATP +

H2O

→

ADP +

Pi

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate +

ADP

→

pyruvate + ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate +

NADH

（高吸收峰）

→

lactate

+ NAD+

（低吸收峰）

產(chǎn)品內(nèi)容

1

YIJI 清理液（Reagent A）

YIJI 裂解液（Reagent B）

YIJI 緩沖液（Reagent C）

YIJI 酶促液（Reagent D）

YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）

YIJI 底物液（Reagent F）

YIJI 陰性液（Reagent G）

產(chǎn)品說明書

毫升

毫升

毫升

微升

毫升

毫升

毫升

1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI 底物液（Reagent F），避免光照，有效保證 6 月

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿：用于光譜分析的容器

分光光度儀：用于光譜分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI 底物液（Reagent F）注

意避光；YIJI 緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定組織重量

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入適量的（1 克組織需要 xx 毫升）YIJI 清理液（Reagent A）清洗 1 次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的 xx 毫升 YIJI 裂解液（Reagent B）

7． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

8． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約 80 下）

9． 將所有組織勻漿物移入 1.5 毫升離心管，放進(jìn) 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 5000g（或

7500RPM，例如 eppendorf 5415）

10．小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

11．（選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心 5 分鐘一次，速度為 5000g（或 7500RPM，

例如 eppendorf 5415）

2

12．即刻移入到 1.5 毫升離心管

13．移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－

GMS30030.1）

14．放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如植物組織裂解樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 37℃）：波長為 340nm，間隔 5 分鐘，讀數(shù) 7 次（共 30 分鐘），并置零

三、 背景對照測定

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 xx 微升 YIJI 陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 30 分鐘

四、 樣品活性測定

1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 YIJI 酶促液（Reagent D）

3． 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 50 微升待測樣品（注意：100 微克總蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 30 分鐘

五、 計算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩

爾吸光系數(shù)）X 10 或 30（反應(yīng)時間，分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

或者

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品重量；毫克）X 6.22（毫摩

爾吸光系數(shù)）X 10 或 30（反應(yīng)時間，分鐘）]＝單位/毫克

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

注意事項

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