細胞無機磷/游離磷酸根離子比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI 細胞無機磷/游離磷酸根離子比色法定量檢測試劑是一種旨在使用硫酸亞鐵氨，在酸性環境下，與游離磷酸根反應，還原產生顯色產物鉬藍，呈現吸光峰值的變化，即采用比色法測定離子濃度的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細胞裂解懸液樣品的無機磷/游離磷酸根離子的檢測。可應用于細胞酶學、結合蛋白成分等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

 

技術背景

 

無機磷/游離磷酸根離子（Phosphate；PO4^-3）作為游離離子存在于水資源系統；作為鹽類分子存在于陸地環境中、巖礦床上等。由于磷酸根離子沒有和生物分子整合，故成為無機磷（inorganic phosphate）。無機磷是陸地和水生植物生長的三大主要營養元素之一，常用于肥料促進農作物生長和發育，也是藻類爆發的原因之一。同時可以用于水質軟化劑（water softener）。無機磷/游離磷酸根離子水平檢測成為水質和環境健康監測的重要指標。在生物體系中，磷作為骨和牙組織的結構元素，也是生物能量分子例如ATP、ADP、AMP等，以及體內磷酸化酶底物的基本元素。通過檢測游離磷酸根水平，反映生物體的磷酸化狀況等。基于游離磷酸根離子，在酸性環境下，與硫酸亞鐵氨反應，還原產生鉬藍顯色產物，呈現吸光峰值的變化，來定量測定無機磷/游離磷酸根離子濃度。  

 

產品內容

 

YIJI 清理液（Reagent A） 毫升

YIJI 裂解液（Reagent B） 毫升

YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升

YIJI顯色液（Reagent D） 毫升

YIJI標準液（Reagent E） 微升

產品說明書   1份

 

保存方式

 

保存YIJI 裂解液（Reagent B）和YIJI顯色液（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI顯色液（Reagent D）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品收集

培養箱：用于孵育反應物

比色皿或酶標板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（5 X 10⁶細胞）
• 小心加入xx毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞 
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取2微升進行蛋白定量測定（注意：建議使用YIJI Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

二、測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）
• 設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為37℃）：波長為660nm，并置零  
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 按下表分別加入YIJI緩沖液（Reagent C）和YIJI標準液（Reagent E）到每個離心管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

 

管號	YIJI緩沖液（Reagent C）	YIJI標準液（Reagent E）	測定體系標準磷濃度
1	xx微升	xx微升	xx微摩爾/升
2	xx微升	xx微升	xx微摩爾/升
3	xx微升	xx微升	x微摩爾/升
4	xx微升	xx微升	xx微摩爾/升
5	xx微升	0	0

 

 

• 標準曲線測定

 

• 移取200微升上述配制的標準液到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI 顯色液（Reagent D），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟1至4四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準磷濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品測定

 

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白） 
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent D），混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品活性對應磷濃度

 

• 計算樣品活性

 

 

七、酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：標準樣品、待測樣品
• 分別移取100微升上述配制的標準液到相應的標準樣品孔里
• 移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到待測樣品孔里
• 加入10微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白）到待測樣品孔里
• 分別加入xx微升YIJI顯色液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動酶標板
• 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準磷濃度（微摩爾/升）
• 根據標準曲線獲得樣品對應磷濃度
• 計算樣品活性

 

注意事項

 

• 本產品為20次（比色皿）和40次（酶標板）操作
• 本產品檢測范圍為20微摩爾以上
• 操作時，須戴手套
• YIJI 顯色液（Reagent D）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
• 樣品切忌使用磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 如果用戶沒有660nm波長，可以使用600至660nm的任一波長替代
• 吸光讀數增高，表明具有無機磷/游離磷酸根離子
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本無機磷/游離磷酸根離子濃度過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供YIJI  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 本公司提供系列離子檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確

 

使用承諾

 

上海一基秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。