 |
|
|||||||||||||||||||||||||||||
| [發(fā)表評(píng)論] [本類其他產(chǎn)品] [本類其他供應(yīng)商] [收藏] | ||||||||||||||||||||||||||||||
| 銷售商： 上海一基實(shí)業(yè)有限公司 | 查看該公司所有產(chǎn)品 >> |
組織GSK3β激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
組織GSK3β激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)多肽底物，在GSK3α抑制劑的存在下，受到GSK3β磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析組織裂解樣品中GSK3β特異活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或完全純化酶樣品中GSK3β激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。
技術(shù)背景
糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3；GSK3；EC 2.7.11.26）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其目標(biāo)蛋白為糖原合成酶和活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T lymphocytes；NFAT），進(jìn)行磷酸化后，抑制其功能，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞對(duì)DNA損傷的反應(yīng)、生物發(fā)育的組織排列（tissue patterning）、蛋白合成、細(xì)胞分化和繁殖等。糖原合成酶激酶3從酵母到人體高度進(jìn)化保留，果蠅中GSK3同源蛋白為Shaggy（Zeste White 3），在Wnt信號(hào)通路中磷酸化β-catenin，導(dǎo)致后者泛素化后降解，防止β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核激活轉(zhuǎn)錄因子。糖原合成酶激酶3本身受到胰島素、生長(zhǎng)因子、蛋白激酶B（protein kinase B）/v-akt鼠源胸腺瘤病毒腫瘤基因同源體（akt）調(diào)控。糖原合成酶激酶3分成兩種異構(gòu)體：糖原合成酶激酶3α和β，其結(jié)構(gòu)相似，功能不同。糖原合成酶激酶3β與tau蛋白磷酸化、能量代謝、神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、機(jī)體形狀構(gòu)成等有關(guān)。糖原合成酶激酶3β功能異常將導(dǎo)致阿茲罕默綜合征等疾病。其磷酸化目標(biāo)序列為GPHRSTPESRAAV。基于底物GPHRSTPESRAAV，在ATP和GSK3α抑制劑Aloisine A的存在下，受到GSK3β激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析糖原合成酶激酶3β的特異活性。其反應(yīng)方式為：
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI 清理液（Reagent A） 毫升
YIJI 裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI 緩沖液（Reagent C） 毫升
YIJI 酶促液（Reagent D） 微升
YIJI 反應(yīng)液（Reagent E） 微升
YIJI 底物液（Reagent F） 微升
YIJI 陰性液（Reagent G） 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存YIJI 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
用戶自備
GSK3β激酶：用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于組織預(yù)處理
比色皿或酶標(biāo)板：用于光譜分析操作的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析
實(shí)驗(yàn)步驟
- 待測(cè)樣品準(zhǔn)備
- 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重500毫克組織重量
- （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入xx毫升YIJI 清理液（Reagent A）清洗
- （選擇步驟）抽去清理液
- 移入到一個(gè)液氮凍存管
- 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
- 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
- 加入置于冰槽里的xx微升YIJI 裂解液（Reagent B）
- 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/em>）
- 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
- 小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管
- 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ0030.1）
- 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
- 測(cè)定準(zhǔn)備
- 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里
- 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
- YIJI 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
- 背景對(duì)照測(cè)定
- 移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI 酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）
- 加入xx微升YIJI 底物液（Reagent F）
- 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入xx微升YIJI 陰性液（Reagent G）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
- 樣品測(cè)定
- 移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI 酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）
- 加入xx微升YIJI 底物液（Reagent F）
- 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入5微升待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
- 計(jì)算樣品活性
- 酶標(biāo)板測(cè)定
- 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
- 分別移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到96孔板中
- 分別加入xx微升YIJI 酶促液（Reagent D）
- 分別加入xx微升YIJI D反應(yīng)液（Reagent E）
- 分別加入xx微升YIJI D底物液（Reagent F）
- 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
- 在30℃溫度下孵育3分鐘
- 分別加入xx微升YIJI D陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
- 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
- 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
- 活性計(jì)算：
七、抑制劑篩選
- 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、完全活性和待測(cè)抑制劑樣品
- 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理
|
內(nèi)容物 |
空背景對(duì)照 |
樣本背景 |
完全酶活性 |
待測(cè)抑制劑酶活性 |
|
YIJI 緩沖液（Reagent C） |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
|
YIJI 陰性液（Reagent G） |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
—— |
|
待測(cè)抑制劑 |
—— |
xx微升 |
―― |
xx微升 |
|
用戶自備的純化酶 |
—— |
—— |
xx微升（1毫單位） |
xx微升（1毫單位） |
|
96孔板每孔總量 |
空背景對(duì)照孔 （xx微升） |
樣本背景孔 （xx微升） |
完全活性孔 （xx微升） |
待測(cè)抑制劑樣品孔 （xx微升） |
|
輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作 |
||||
- 分別移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
- 分別加入xx YIJI 酶促液（Reagent D）
- 分別加入xx微升YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）
- 分別加入xx微升YIJI 底物液（Reagent F）
- 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
- 在30℃溫度下孵育3分鐘
- 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
- 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀30分鐘
- 抑制活性計(jì)算：
注意事項(xiàng)
- 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景操作
- 操作時(shí)，須戴手套
- 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
- 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
- 樣品須澄清，至關(guān)重要
- 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定
- 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘
- 光譜測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
- 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
- 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
- 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
- 可以使用GSK3β抑制劑噻二唑烷酮-8（thiadiazolidinone-8；TDZD-8）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
- 糖原合成酶激酶3β活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
- 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
使用承諾
上海一基秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書(shū)所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書(shū)面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。
24小時(shí)電話： 13311756131
客服: QQ:2851717098
